Что значит фракция внеклеточной фетоплацентарной днк
Что такое НИПТ и почему об этом исследовании столько говорят в последнее время? Какие преимущества у данных тестов? Кому они показаны и существуют ли ограничения? Сегодня мы найдём ответы на эти и другие актуальные вопросы.
Биохимические скрининговые программы не обладают высокой точностью, они основаны на cовокупности данных статистики, уровня гормонов и размеров плода по УЗИ. Амниоцентез – самый точный метод, но он инвазивный (нужно сделать прокол плодного пузыря, чтобы получить для исследования клетки, принадлежащие плоду) и угрожает развитием осложнений и прерыванием беременности.
Медицинская наука не прекращала поиски новых тестов для скрининга, которые были бы более точны и не зависели от расчётных показателей. В качестве скрининговых тестов в последнее время хорошо себя зарекомендовали НИПТ (неинвазивные пренатальные тесты) как надёжные, удобные и не мешающие нормальному протеканию беременности. Точность метода достигает 99,9%, так как исследуется генетический материал плода (его ДНК) в венозной крови будущей матери.
Как это возможно? Учёные выяснили, что начиная примерно с 10 недели беременности в крови женщины свободно циркулирует ДНК плода. Благодаря современным технологиям врачи научились выделять её и исследовать, выявляя самые распространенные изменения хромосом.
Таким образом, почти каждая женщина может сдать венозную кровь, дождавшись срока 10 недель беременности, и определить генетическое здоровье будущего малыша.
В каких случаях исследование с применением НИПТ будет наиболее полезно?
В спектре лаборатории KDL представлено несколько комплексов НИПТ. Они отличаются объёмом исследования, показаниями и ограничениями. Важно чтобы понять, какой тест подходит именно Вам.
В каких случаях выполнение НИПТ невозможно?
Итак, выполнение неинвазивных пренатальных тестов возможно при одноплодной и двуплодной беременности. Если беременность одноплодная естественная или наступила после ЭКО с использованием собственной яйцеклетки, то доступны все исследования НИПТ. В остальных случаях существуют ограничения.
В чем отличия разных тестов линейки НИПТ?
НИПС Т21 (Геномед)- диагностика только синдрома Дауна. В исследовании выявляется дополнительная 21 хромосома, если она есть у плода. Синдром Дауна считается одной из самых частых хромосомных аномалий и его частота растёт с увеличением возраста женщины. Выполняется при беременности вследствие естественного зачатия, при ЭКО с собственной яйцеклеткой или при использовании донорской яйцеклетки; при беременности одним плодом и двойней, а также при суррогатном материнстве и если произошла редукция одного эмбриона в двойне.
НИПС 5 – ДНК тест на 5 синдромов (Геномед) – неинвазивный тест на 5 синдромов, можно определить аномалии 13, 18, 21 и в большинстве исследований выявить аномалии половых хромосом X и Y.
НИПС 5 универсальный, его выполнение возможно как при одноплодной естественной беременности, так и при беременности двойней, при носительстве донорской яйцеклетки, суррогатным матерям и в том случае, когда один плод в двойне редуцирован.
3 тестовые базовые панели:
Базовые панели позволяют выявить хромосомные аномалии 13,18, 21, Х и Y хромосом плода, а также триплоидии.
НИПС (Геномед) – включает определение вышеперечисленных синдромов (скрининг 13, 18, 21, Х, Y хромосом плода) и определение носительства у матери частых мутаций, которые могут привести к наследственным болезням, если ребенок унаследует два дефектных рецессивных гена от обоих родителей или один доминантный ген. Данные мутации выявляются в крови без выделения ДНК плода, т.е. оценивается не хромосомная мутация плода, а наличие аномальных вариантов генов у матери.
Генетические заболевания, связанные в тестируемыми в этом исследовании вариантами генов:
НИПС уникален не только клинической значимостью, но и доступностью. Одноплодная беременность, беременность двойней (с определением зиготности), в том числе при редукции одного из эмбрионов в двойне. При ЭКО с донорской яйцеклеткой и суррогатном материнстве этот тест нецелесообразен, так как определять мутации, связанные с генетическими заболеваниями нужно по крови той женщины, чья яйцеклетка дала начало эмбриону.
Следующие 2 панели включают микроделеционные синдромы:
Микроделеции – это поломки сегмента хромосом, которые являются менее распространенными, но не менее опасными, и их невозможно заподозрить на УЗИ.
НИПТ Panorama, расширенная панель (Natera) – исследуются и стандартные аномалии хромосом (13,18,21, Х, Y, триплоидии) и микроделеционные синдромы. Если у Вас беременность одноплодная естественная или в результате ЭКО с собственной яйцеклеткой, то выполнение данных панелей возможно.
При наличии двух плодов, ЭКО с донорской яйцеклеткой и суррогатном материнстве определить сегментарные нарушения технически невозможно.
Можно ли определить пол плода и в каких случаях?
Да, по желанию женщины любой НИПТ определяет пол плода и это доступно как при одноплодной, так и при двуплодной беременности.
Обращаем Ваше внимание, что получение результатов, указывающих на риски развития патологических синдромов, требует консультации генетика и дополнительной инвазивной диагностики.
Фетоплацентарная ДНК — новый пазл в пренатальной диагностике
При каждой беременности существует риск хромосомных нарушений. Наиболее диагностически значимым является выявление анеуплоидий, то есть наличия аномального числа хромосом в клетке (в отличие от эуплоидной клетки с 46 хромосомами).
Установленные программы скрининга определяют риск возникновения синдрома Дауна (относительно высокая частота — 1/800 живорождений), также рассматривают синдром Эдвардса (трисомия 18), синдром Патау (трисомия 13) и синдром Шерешевского-Тернера (чаще полное отсутствие одной из Х хромосом — моносомия 45, X0, либо аномалии второй Х-хромосомы) [1].
Пренатальная диагностика и скрининг проводятся как инвазивными, так и неинвазивными методами. Инвазивные подходы, такие как взятие проб ворсин хориона (CVS) и амниоцентез, включают хирургическое введение зондов в матку и являются высокоточными. Хромосомный анализ культивируемых ворсин хориона и клеток амниотической жидкости может выявить не только анеуплоидию плода (рис. 1), но и структурные перестройки, такие как транслокации и инверсии, а также относительно большие дупликации и делеции, обычно размером более 5 мБ (мБ — мегабаза, единица длины фрагмента ДНК, равная 1 млн нуклеотидов) [2]. Хромосомный анализ клеток околоплодных вод считается «золотым стандартом» в пренатальном скрининге ввиду крайне низкого процента ошибок (менее 0,01–0,02 %). Кроме методов обычной цитогенетики, используются молекулярно-генетические исследования: флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция в реальном времени (QF-ПЦР) и мультиплексная, зависимая от лигирования амплификация зонда (MLPA). Данные методы позволяют получить более быстрый результат, но имеют ограничения по спектру выявляемой патологии, для них рекомендовано дальнейшее подтверждение кариотипированием. Однако все инвазивные методы вызывают физический дискомфорт и потенциально вредны для плода, а также ассоциируются с 1–2 % риском потери беременности [1].
Рисунок 1 | Кариотипирование — синдром Дауна: 47, XY, + 21, трисомия 21 [2].
Напротив, неинвазивные тесты на основе изменения уровня внеклеточной эмбриональной ДНК (cell-free DNA, cfDNA) являются безопасными и обеспечивают раннее обнаружение распространенных анеуплоидий со значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, по сравнению с ультразвуковым исследованием. В 1997 году Lo с коллегами обнаружили ДНК фетальных трофобластов в крови матери. Часто используется термин «эмбриональная ДНК», хотя происходит она из структур плаценты, поэтому более точным является понятие фетоплацентарной ДНК (рис. 2) [3]. Постоянное обновление ворсинчатого трофобласта приводит к вытеснению апоптотического материала в материнскую циркуляцию. При этом бесклеточная фетоплацентарная ДНК составляет всего 3 % от общей бесклеточной циркулирующей ДНК на ранних сроках беременности, увеличиваясь до 6 % на поздних сроках беременности. Отличить собственно материнскую и фетоплацентарную внеклеточную ДНК позволяет значительно меньшие размеры последней — около 200 пар нуклеотидов [4].
Рисунок 2 | Неинвазивная пренатальная диагностика с использованием анализа внеклеточной фетоплацентарной ДНК.
Real-time ПЦР — количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени — используется для одновременной амплификации (увеличения числа копий) и измерения количества данной молекулы ДНК. Измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. MPS — массивное параллельное секвенирование или секвенирование следующего поколения (next-generation sequencing, NGS). Секвенирование — анализ последовательности нуклеотидов в составе макромолекул, являющихся единицами наследственной информации.
Соответственно, неинвазивный пренатальный скрининг (NIPS) становится все более распространенным в качестве надежной процедуры выявления анеуплоидий. Американский колледж медицинской генетики и геномики (ACMG) предложил NIPS всем беременным женщинам, независимо от их статуса риска для скрининга анеуплоидий с участием хромосом 21, 18 и 13 [5].
На сегодняшний день подавляющее большинство методов NIPS используют массивное параллельное секвенирование (MPS) или секвенирование нового поколения (next-generation sequencing, NGS), позволяющее одновременно определять нуклеотидные последовательности множества различных нитей ДНК, для измерения количества хромосомных копий с использованием cfDNA, полученной из материнской плазмы, в которой ДНК фетоплацентарного происхождения составляет от 2 % до 40 % от общей свободной ДНК. Фактическая фракция ДНК плода зависит от таких факторов, как гестационный возраст (концентрация возрастает с увеличением срока гестации, раннее обнаружение возможно уже с 5 недели и практически всегда — с 7 недели), вес матери (обратная зависимость: чем выше вес, тем меньше концентрация) и метод экстракции. Для анализа секвенирования используется такой показатель как фракция плода (ff). Ff — это количество внеклеточной эмбриональной ДНК в данном образце по отношению к общему количеству внеклеточной ДНК. В любом гестационном возрасте ff имеет нормальное (Гауссово, симметричное, колоколообразное) распределение, которое достигает максимума между 10 и 20 % на 10–21 неделе [6].
Повышение уровня фетальной внеклеточной ДНК в материнской крови отражает активацию апоптотических, некротических и воспалительных процессов в плаценте, что делает этот маркер перспективным для оценки риска развития таких осложнений беременности, как преэклампсия, преждевременные роды, задержка роста плода [7].
Внеклеточная фетоплацентарная ДНК является новым биомаркером, который может стать важным фрагментом в воспроизведении полной картины плоидности эмбриона, состояния плаценты, прогнозирования различных клинических проблем. Трудности в интерпретации все еще сохраняются, требуется более полное изучение факторов, влияющих на выработку, метаболизм и клиренс фетоплацентарной ДНК. Важным ограничением использования cfDNA является то, что пациентки с низкой фракцией плода для своего срока гестации, приводящей к «нерегистрируемому результату», зачастую имеют повышенный риск анеуплоидии плода. В этом случае требуется применение инвазивных методов цитогенетики.
Что значит фракция внеклеточной фетоплацентарной днк
Риск развития хромосомных аномалий у будущего ребенка напрямую зависит от возраста матери. Чем старше женщина, тем такой риск выше. Тем не менее, большинство детей с синдромом Дауна рождается у женщин моложе 35 лет, потому что в данной возрастной категории происходит большее количество родов. По этой причине пренатальный скриниг важно проводить женщинам любого возраста.
Сегодня для пренатального выявления врожденных пороков развития и хромосомных аномалий будущего ребенка во всем мире проводится скрининг 1 триместра беременности, основанный на оценке возраста матери, ультразвуковых и биохимических показателях. Хуан Акуна отметил, что «информативность такого обследования в реальности не превышает 70%». По его результатам 1 из 20 будущих мам ставится высокий риск рождения ребенка с хромосомной аномалией. Чтобы получить точный ответ, женщин с высоким риском направляют на так называемую инвазивную диагностику (прокол плодных оболочек и взятие материала для определения хромосомного набора ребенка). Инвазивная процедура несет риски прерывания беременности и поэтому многие женщины часто от нее отказываются. При этом у 99 из 100 женщин по результатам инвазивной диагностики патологии не выявляется и оказывается, что исследование проводилось зря.
По словам профессора Хуана Акуны в дополнение к традиционному скринингу специалистам необходим метод, который позволит существенно снизить столь высокую частоту проведения инвазивной диагностики. И сегодня таким методом является неинвазивная пренатальная диагностика – исследование ДНК плода по крови беременной женщины. По данным разных исследований, неинвазивная диагностика повышает частоту выявления хромосомных аномалий до 99%, существенно снижает процент ложноположительных результатов до 0,08%, а значит, снижает частоту неоправданных инвазивных вмешательств.
Неинвазивную диагностику можно проводить с 10-й недели беременности. Ее точность зависит от количества ДНК плода ребенка (фетальная фракция) в крови женщины. Чтобы получить достоверный диагностический результат фетальная фракция должна составлять не менее 4%. Исследования показали, что у 2% женщин в крови содержится менее 4% ДНК ребенка. К сожалению не все неинвазивные тесты предусматривают измерение количества фетальной фракции перед проведением диагностики. По данным обширных исследований, проведенных на более чем 22 000 женщин, самой достоверной в настоящее время является методика Harmony. Чувствительность этого теста составляет 100%. В России это исследование известно под названием Prenetix.
Хуан Акуна также отметил, что «неинвазивная пренатальная диагностика является лучшим из всех доступных в клинической практике методов скрининга хромосомных аномалий плода. Исследование существенно превосходит биохимические методы, но не заменяет ультразвуковое исследование».
Внеклеточная ДНК и количество митохондриальных повторов при преэклампсии и гестационной артериальной гипертензии
Работа призёра открытой городской научно-практической конференции «Старт в медицину» в секции «Анатомия и физиология человека»
Актуальность
Нормальные значения концентрации вкДНК способны оказывать супрессорное влияние на иммунитет матери, обеспечивая толерантность её иммунной системы к плоду. Секреция вкДНК характерна для клеток плаценты при различных осложнениях беременности, часто – в составе двумембранных экзосом. Гибель клеток плаценты приводит к выбросу в плазму матери большого количества вкДНК. Характеристики экзосом материнской плазмы, содержащих вкДНК, могут достоверно указывать на вероятность преждевременных родов. Понимание механизма возникновения преэклампсии и гестационной артериальной гипертензии, которые в настоящий момент являются основной причиной материнской смертности в мире, является одной из актуальных задач медицины.
Цель
Исследовать количество митохондриальных повторов в гДНК (геномная ДНК) клеток крови и вкДНК (внеклеточная ДНК) образцов плазмы женщин с нормально протекающей беременностью и беременных женщин с преэклампсией или гестационной артериальной гипертензией.
Задачи
1. Сформировать группу контроля, состоящую из женщин с нормально протекающей беременностью, группу женщин с преэклампсией и гестационной артериальной гипертензией.
2. Выделить гДНК из клеток цельной крови, вкДНК из образцов плазм женщин, участвующих в исследовании.
3. Провести измерения.
4. Проанализировать полученные результаты.
Оснащение и оборудование, использованное в работе
Описание работы
Для исследования были сформировали две группы беременных женщин: контрольная группа, включающая 30 женщин с нормально протекающей беременностью, и группа беременных женщин с преэклампсией разной степени тяжести или гестационной артериальной гипертензией (49 пациенток). С помощью метода фенольной экстракции была выделена геномная ДНК из клеток цельной крови и внеклеточная ДНК из образцов плазм. Автор измерил концентрации геномной ДНК в образцах, а затем с помощью спектрофотометрии уровнял концентрации во всех образцах до 25 нг/мл. Концентрация вкДНК определялась при помощи флюорометрии с использованием реактива PicoGreen Invitrogen. Метод нерадиоактивной дот-гибридизации и ПЦР Real-time позволил определить количество митохондриальных повторов в геномной и внеклеточной ДНК. Автором были проанализированы статьи, описывающие исследования генетических и эпигенетических факторов развития преэклампсии и гестационной артериальной гипертензии.
Результаты
Данные исследования показали, что количество митохондриальных повторов в геномной ДНК у женщин с преэклампсией и гестационной артериальной гипертензией незначительно ниже, чем у женщин из контрольной группы. Уровень внеклеточной митохондриальной ДНК (мтДНК) у больных женщин выше в 4 раза по сравнению с женщинами, у которых беременность протекает нормально.
Выводы
1. Активация патологических механизмов при преэклампсии может привести к увеличению, по сравнению с контролем, количества митохондрий в клетке. Это говорит об увеличении количества митохондриальной ДНК и об активации синтеза АФК (активные формы кислорода).
2. В ответ на окислительный стресс значительная часть мтДНК элиминировалась в межклеточное пространство и плазму крови в составе экзосом. Таким образом, количество мтДНК внутри клетки при преэклампсии и гестационной артериальной гипертензии уменьшено по сравнению с контролем, но незначительно. А количество внеклеточной мтДНК увеличено многократно.
3. Количество митохондриальных повторов является маркером преэклампсии и гестационной артериальной гипертензии.
4. Многократное увеличение концентрации мтДНК в образцах плазм крови женщин с преэклампсией и гестационной артериальной гипертензией указывает на вероятное участие мтДНК в патогенезе данного заболевания и требует дальнейших исследований роли мтДНК и вкДНК при беременности.
Перспективы использования результатов работы
Результаты работы могут быть использованы в целях поиска новых ранних маркеров преэклампсии и гестационной артериальной гипертензии, а также для лучшего понимания патогенеза данных осложнений беременности.
Сотрудничество с учреждением при создании работы
ФГБНУ «МГНЦ», лаборатория молекулярной биологии
Мнение автора
«Работа имеет большой потенциал, но требует доработки и дальнейшего развития. Конференция «Старт в медицину» помогла познакомить с работой окружающих и показала, какие существуют недочёты в оформлении работы. Пожелание организаторам конференции: расширить список направлений тематических секций»
Низкая фетальная фракция внеклеточной ДНК при проведении неинвазивного пренатального ДНК-скрининга: возможные причины, клиническое значение и тактические решения
Цель исследования: провести сравнение частоты хромосомных аномалий (ХА) у плодов при первичном и повторном неинвазивном пренатальном ДНК-скрининге (НИПС) в связи с низким уровнем фетальной фракции или низким качеством внеклеточной эмбриональной ДНК.
Дизайн: ретроспективное когортное исследование.
Материалы и методы. В исследование включены 21 042 женщины, которым был проведен НИПС в России в 2013–2018 гг. Основную группу составили согласившиеся на повторный НИПС 1025 из 1044 пациенток с неинформативными данными исследования (низкое содержание фетальной фракции, не дающее возможность определить риск ХА). В контрольную группу вошли 19 998 женщин с информативным НИПС при первичном исследовании. Группу исключения составили женщины с низким уровнем фетальной фракции, отказавшиеся от повторного скрининга. Метод исследования — таргетный НИПС. Проводили забор крови из вены и центрифугирование крови для получения плазмы. Внеклеточную фетальную ДНК анализировали с помощью метода NGS (метода секвенирования однонуклеотидных полиморфизмов, запатентованного компанией Natera).
Результаты. НИПС оказался нерезультативным у 1044 (5%) пациенток, у 821 (80,1%) из 1025 со второго раза был получен результат. Среди участниц, получивших результат при первичном исследовании, частота хромосомных анеуплоидий составила 2,4%. Среди тех пациенток, у которых провели повторное результативное исследование НИПС, ХА у плода в итоге были выявлены у 27 (3,3%). В подгруппе женщин, только с третьего раза получивших результат, распространенность ХА — 9,3% (7 случаев из 75). Показано, что в I триместре средний уровень фетальной фракции у беременных с трисомиями 18, 13 или моносомией Х значимо ниже, чем в норме. Во II триместре значимо более низкий уровень фетальной фракции по сравнению с нормой определялся при наличии трисомии 18 или моносомии Х. Получены статистически значимые различия между уровнями фетальной фракции у пациенток с массой тела Заключение. Риск выявить ХА у плода при повторном НИПС значимо выше, чем при первичном исследовании. В случае неинформативного теста пациентке целесообразно повторно выполнить скрининг, если он не даст результатов, необходимо решать вопрос о проведении инвазивной пренатальной диагностики. С повышением массы тела пациентки снижается уровень фетальной фракции, в связи с чем женщинам с избыточной массой тела и ожирением следует рекомендовать другие методы пренатальной диагностики.
Вклад авторов: Кудрявцева Е.В. — сбор клинического материала, обзор публикаций по теме статьи, статистическая обработка данных, написание текста рукописи; Ковалёв В.В. — разработка дизайна исследования; Баранов И.И. — проверка критически важного содержания, утверждение рукописи для публикации; Канивец И.В. — сбор клинического материала; Киевская Ю.К. — сбор клинического материала, обзор публикаций по теме статьи; Коростелёв С.А. — сбор клинического материала, проверка критически важного содержания.
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.