Что относится к катионным противомикробным пептидам
Антимикробные пептиды — возможная альтернатива традиционным антибиотикам
Антимикробный пептид на поверхности модели бактериальной мембраны. Связывание пептида приводит к дестабилизации мембраны и проникновению воды внутрь бислоя.
Автор
Редакторы
После появления пенициллина более чем 80 лет человечество ведет ожесточенную борьбу с патогенными микроорганизмами. Широкое использование антибиотиков в терапии инфекционных заболеваний породило новые устойчивые к ним формы бактерий. На пороге XXI века медики и фармацевты столкнулись с проблемой поиска альтернативы традиционным антибиотикам. Для этой цели использование антимикробных пептидов может оказаться весьма эффективным.
Уроки «80-летней войны»
Со времен открытия Флемингом пенициллина в 1928 г. фармацевтами были созданы тысячи различных антибиотиков. Во второй половине XX века бытовало мнение, что, благодаря вакцинации и активному использованию антибиотиков, с инфекционными заболеваниями будет покончено раз и навсегда. Однако быстрой и легкой победы над патогенными микроорганизмами достичь не удалось. Фактически, человечество простилось только с оспой. В цивилизованных странах в последние годы часто наблюдаются рецидивы ряда «забытых болезней» (бубонная чума, коклюш и пр.), в то время как в странах «третьего мира» ни о какой, даже временной победе над инфекциями, говорить не приходиться. И это не единственная проблема. Оказалось, что любые бактерии способны достаточно быстро (от нескольких месяцев до нескольких лет) выработать устойчивость (резистентность) к практически любому антибиотику [1]. Таким образом, стремительный рост числа вводимых в клиническую практику структурно новых антибиотиков, наблюдавшийся в середине прошлого столетия, сменился длительным инновационным кризисом, который продолжается и сегодня [2]. Более того, широкое применение антибиотиков в качестве лекарственных препаратов привело к накоплению устойчивых форм микроорганизмов. Распространены случаи устойчивости целого ряда патогенов человека (Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae и пр.) практически к любому из применяемых препаратов [3].
Рисунок 1. Представители различных групп антимикробных пептидов.
1 — Линейные α-спиральные; 2 — не имеющие характерной структуры, напр. богатые определенной аминокислотой; 3 — дефензины; 4 — лантибиотики (низин).
Основная цепь пептидов изображена в виде ленты (1, 2). Фрагменты β-слоя представлены стрелками (3). Для низина (4) показаны также боковые цепи остатков.
Антимикробные пептиды
По-видимому, принципиально новым классом природных антибиотиков, которые могут прийти на смену традиционным препаратам, являются так называемые антимикробные пептиды [4]. Это относительно короткие молекулы (в среднем порядка 30–40 аминокислот), способные убивать клетки микроорганизмов. Антимикробные пептиды служат первичной мерой защиты от патогенов и задействованы в системе врожденного иммунитета. На сегодняшний день охарактеризовано более 800 таких пептидов. Они включают в себя молекулы из многих тканей и типов клеток беспозвоночных, позвоночных, растений и грибов; некоторые хемокины, цитокины, нейропептиды, нейрогормоны и фрагменты белков. Также ряд пептидов производится собственно микроогранизмами. Например, Lactococcus casea, молочнокислые бактерии — популярная добавка ко всяким «иммунизирующим» йогуртам, — продуцируют высокоактивный пептид низин.
Несмотря на огромное разнообразие, на основании структурной организации антимикробные пептиды можно разделить на несколько групп:
Тем не менее, для большинства таких пептидов характерно несколько общих черт: высокий положительный заряд (+2 — +9), пространственное разделение гидрофобных и гидрофильных участков молекулы (амфифильность). Амфифильность является важной особенностью антимикробных пептидов, которая обеспечивает возможность одновременно выгодно взаимодействовать с гидрофобным ядром липидной мембраны и полярным окружением (например, с водой).
Механизмы действия
Выделяют два основных типа воздействия антимикробных пептидов на клетки: ингибирование метаболитических процессов или нарушение целостности клеточной мембраны [5]. Большинство антимикробных пептидов вызывают гибель клетки по второму механизму. Лишь для некоторых пептидов показано действие по первому типу, среди них лантибиотики, которые селективно связываются с предшественником бактериальной стенки [6]. Для того, чтобы достигнуть плазматической бактериальной мембраны, пептиды предварительно должны преодолеть несколько слоев клеточной стенки. В случае грам-отрицательных бактерии она состоит из внешней липополисахаридной мембраны и пептидогликанового слоя. У грам-положительных бактерий внешняя мембрана отсутствует, однако пептидогликановый слой развит гораздо сильнее. Пептиды обычно беспрепятственно достигают плазматической мембраны, и именно ее разрушение приводит гибели клетки.
Перспективы использования антимикробных пептидов в медицине
Рисунок 2. Антимикробный пептид рамопланин (Ramoplanin).
Продукт нерибосомального синтеза в микроорганизмах рода Actinomycetes spp. Механизм действия основан на связывании с предшественником бактериальной стенки липидом II. На данный момент находится на клинических испытаниях фазы III в качестве антибиотика против инфекций дыхательных путей (в первую очередь, стафилококков).
Несмотря на то, что для антимикробных пептидов характерно довольно высокие действующие концентрации (
10 −7 —10 −6 моль, 10 −9 моль у лантибиотиков) и низкая селективность, они обладают некоторыми преимуществами: способность быстро убивать клетки-мишени, широкий спектр действия, активность в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, а также относительная трудность в развитии устойчивости. Поскольку некоторые антимикробные пептиды обладают цитотоксическим эффектом (действуют на эукариотические клетки), наиболее эффективно они могут быть использованы при лечении заболеваний наружных покровов, слизистых — без введения в кровь пациента. На сегодняшний день такие пептиды активно используются для создания новых лекарственных препаратов. Наиболее успешным примером, является циклический пептидный антибиотик рамопланин, который уже находится на стадии клинических испытаний для лечения инфекционных заболеваний дыхательных путей. Также показано, что ингаляции смеси, содержащей антимикробные пептиды, являются эффективными в терапии туберкулеза.
Все это позволяет рассматривать описанные выше молекулы в качестве основы для создания эффективных лекарств, особенно на фоне снижения потенциала обычных антибиотиков.
Что относится к катионным противомикробным пептидам
АМП являются неспецифическими факторами гуморального иммунитета, обладают эндотоксин-нейтрализующей и иммуномодулирующей активностью, а также обеспечивают защиту против широкого спектра микроорганизмов [16]: грамотрицательных и грамположительных бактерий, грибов, вирусов и простейших [2].
О существовании АМП известно уже несколько десятилетий, но только недавно интерес к этим молекулам перешел из плоскости фундаментальных исследований иммунной системы в клиническую область. На сегодняшний день у человека обнаружено три семейства таких пептидов [7; 16; 18]: дефензины, кателицидины и гистатины.
Основными продуцентами β-дефензинов являются кератиноциты, эпителиоциты слизистых оболочек, макрофаги, моноциты, дендритные клетки [5].
Активация нейтрофилов при инфекционных и воспалительных процессах приводит к быстрому высвобождению дефензинов, которые затем обнаруживаются в плазме и других жидкостях организма. В нормальной плазме обнаруживается очень низкий уровень дефензинов (от неопределяемых величин до 50-100 нг/мл), однако в условиях сепсиса содержание их может возрасти до 10 мг/мл и даже выше. К примеру, нарушение активации цитокинов и дефензинов на поверхностном эпителии репродуктивного тракта влечет за собой внедрение возбудителя даже при малом его количестве [15].
Помимо всего вышеперечисленного, дефензины экспрессируются на всем протяжении репродуктивного тракта женщин, где выполняют ряд функций, которые играют ключевую роль в сохранении и защите плода во время беременности. Более глубокое понимание функций дефензинов и механизмов их действия позволит рассматривать их в качестве терапевтических средств контроля заболеваний женщин, включая осложнения беременности и послеродового периода [26].
Значительное повышение содержания LL37 отмечено в семенной плазме и на поверхности сперматозоидов у здоровых доноров. Считается, что LL37 предотвращает поражение сперматозоида микроорганизмами на пути к яйцеклетке и во время оплодотворения. Недостаточность LL37 в слюне согласуется с наличием заболевания периодонта у пациентов с болезнью Костманна. Известно, что больные атопическим дерматитом с дефицитом экспрессии LL37 чаще страдают вакцинальной экземой.
LL37 устойчив к протеолитическому разрушению и, в ограниченной степени, цитотоксичен по отношению к клеткам млекопитающих. Установлено, что нормальное содержание LL37 в плазме составляет 1,2-1,8 мкг/мл. Во время инфекционных заболеваний концентрация этого белка повышается [17].
Большой проблемой современности является развитие резистентности (способности микроорганизмов развиваться и размножаться при внедрении химического препарата, который обычно действует на уничтожение этих микробов или на прекращение их роста) микроорганизмов к антимикробным препаратам [4; 23].
Механизм действия антимикробных пептидов универсален, вследствие чего они губительны даже для тех микроорганизмов, которые выработали устойчивость к различным антибиотикам в процессе эволюции [22].
Существуют значительные различия структуры клеточной стенки и клеточной мембраны у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Грамположительные бактерии содержат наружную клеточную стенку, состоящую из многих слоев пептидогликана, под которой находится клеточная мембрана [6]. Грамотрицательные бактерии обладают наружной клеточной мембраной, содержащей большое количество липополисахарида, а также истинной внутренней цитоплазматической мембраной [14]. Последняя покрыта меньшим, чем у грамположительных бактерий, числом полигликановых слоев и отделена от наружной мембраны периплазматическим пространством. Таким образом, грамотрицательные бактерии обладают серьезным барьером на пути проникновения лекарств. Липофильные препараты или водорастворимые вещества с низкой молекулярной массой могут проходить через пориновые каналы. Изменения содержания или состава пориновых белков или липополисахаридов наружной мембраны могут обусловить возникновение резистентности вследствие снижения проницаемости к антибиотикам.
Универсальность действия на микроорганизмы, а также способность быстро поражать клетки-мишени и широкий спектр действия позволяют рассматривать антимикробные пептиды в качестве основы для создания новых лекарств, особенно на фоне глобальной проблемы снижения эффективности обычных антибиотиков. Однако стоит обратить внимание на то, что многие натуральные пептиды помимо чужеродных микроорганизмов способны разрушать эритроциты крови [17]. В этом и состоит сложность использования АМП в медицине. Механизм действия пептидов по сей день слабо изучен, поэтому направленный синтез молекул, при котором пептиды бы действовали исключительно на возбудителей, не причиняя вреда клеткам человека, пока невозможен.
Но, несмотря на недостаточную изученность, в последние годы обрисовались перспективы применения антимикробных пептидов в клинической практике. Так, в Европе уже проходят клинические исследования медикамента, основу которого составляет антимикробный пептид, полученный из секрета мушки дрозофила. Он показывает достаточный уровень эффективности в борьбе с тяжёлой грибковой инфекцией, которая часто прогрессирует после химиотерапии или трансплантации органов. Антимикробные пептиды начинают активно вырабатываться клетками человеческого организма при локальных повреждениях или наличии болезнетворных микроорганизмов. Поэтому они оптимальны в терапии местных воспалений.
Клиническое применение эндогенных антимикробных пептидов затрагивает широкий круг проблем современной теоретической и прикладной науки [17]. Многие аспекты применения АМП еще до конца не изучены. Тем не менее эта тема заслуживает пристального внимания и дальнейшей разработки.
Рецензенты:
Белый Л.Е., д.м.н., профессор кафедры госпитальной хирургии, анестезиологии, реаниматологии, урологии, травматологии и ортопедии МФ ИМЭиФК УлГУ, г. Ульяновск;
Кан Н.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой последипломного образования и семейной медицины ФПМиФО ИМЭиФК УлГУ, г. Ульяновск.
Что относится к катионным противомикробным пептидам
ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, Москва, Россия
Кафедра биологической химии стоматологического факультета ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, Москва, Россия
Кафедра биохимии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России
Антимикробные пептиды — многофункциональная защита тканей полости рта
Журнал: Российская стоматология. 2015;8(3): 3-12
Вавилова Т. П., Деркачева Н. И., Островская И. Г. Антимикробные пептиды — многофункциональная защита тканей полости рта. Российская стоматология. 2015;8(3):3-12.
Vavilova T P, Derkacheva N I, Ostrovskaia I G. Antimicrobial peptides — the multifunctional protection of the tissues of the oral cavity. Russian Stomatology. 2015;8(3):3-12.
https://doi.org/10.17116/rosstomat2015833-12
ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, Москва, Россия
В настоящем обзоре рассматриваются функции и механизм действия антимикробных пептидов в полости рта. Антимикробные пептиды обеспечивают первую линию защиты тканей полости рта от внедрения патогенов. В ротовой полости обнаружено несколько групп антимикробных пептидов, имеющих разное происхождение и проявляющих активность против бактерий, грибов и вирусов, а также обладающих свойствами иммуномодуляторов и хемоаттрактантов. Антимикробные пептиды играют важнейшую роль для поддержания здоровья в полости рта. Показано, что нарушение их синтеза коррелирует с развитием пародонтита и множественного кариеса зубов. Обсуждаются возможности практического применения антимикробных пептидов для диагностики и лечения заболеваний ротовой полости.
ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, Москва, Россия
Кафедра биологической химии стоматологического факультета ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, Москва, Россия
Кафедра биохимии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России
Микрофлора полости рта человека чрезвычайно разнообразна и в норме представлена несколькими сотнями видов микроорганизмов [1]. При заболеваниях пародонта, как правило, изменяется количественное соотношение микробов, а их видовой состав остается постоянным. Это обстоятельство позволяет предполагать, что причиной заболеваний тканей полости рта является не собственно бактериальная инфекция, а нарушение адекватного взаимодействия макроорганизма с микрофлорой [2]. В связи с этим у исследователей особый интерес вызывает изучение защитных систем ротовой полости.
Следует отметить, что полость рта является главными воротами для проникновения инфекции в организм человека. С вдыхаемым воздухом и пищей на слизистой оболочке осаждается огромное количество различных микроорганизмов, в том числе и болезнетворных. При этом подавляющее большинство патогенов успешно и очень быстро обезвреживается уже в момент проникновения, что указывает на мощную систему антибактериальной защиты в полости рта человека. Эта защита носит многофакторный и многокомпонентный характер. Во-первых, слизистая оболочка полости рта создает физический барьер для внедрения микроорганизмов. Во-вторых, при попадании микробов эпителиальные клетки выделяют цитокины и секреторный иммуноглобулин А, что активирует приток нейтрофилов в десневую бороздку [3]. В третьих, важнейшие антимикробные функции выполняют слюнные железы. В слюне обнаружено множество факторов неспецифической и специфической защиты от патогенов: муцины, антибактериальные пептиды, ферменты, антитела, белки системы комплемента и др. [4].
Среди защитных факторов ротовой полости особое место занимают антимикробные пептиды (АМП). Это небольшие молекулы, содержащие от 12 до 50 аминокислотных остатков, способные убивать клетки микроорганизмов. Большинство известных в настоящее время АМП обладают широким спектром антимикробной активности, действуя против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжей и некоторых вирусов [3]. Кроме того, получены убедительные доказательства, что ряд АМП обладает антиканцерогенной активностью, а также является иммуномодуляторами [5, 6].
В настоящее время стало ясно, что в ротовой полости АМП не только уничтожают патогенные микроорганизмы, но и участвуют в поддержании нормальной микрофлоры [3].
Несмотря на различия в первичной структуре, все АМП обладают рядом общих характеристик. Большинство АМП являются амфифильными молекулами: содержат положительно заряженные аминокислотные остатки аргинина, лизина или гистидина, а также более 50% неполярных аминокислот. Их наличие позволяет АМП взаимодействовать с липидным бислоем плазматической мембраны патогенов и нарушать его структуру и целостность. Кроме того, многие АМП оказывают влияние на различные внутриклеточные процессы.
В полости рта обнаружены следующие виды АМП: α- и β-дефензины, гистатины, адреномедуллин и кателицидины человека [7], источниками которых являются слизистая оболочка ротовой полости, слюнные железы и нейтрофилы. Происхождение различных групп АМП ротовой полости представлено на рис. 1.
Рис. 1. Происхождение АМП в ротовой полости.
Наибольшее количество АМП вырабатывается именно в слизистой оболочке полости рта, поскольку эпителий активно реагирует на сигналы из окружающей среды, на инфекцию, интегрируя врожденные и приобретенные иммунные реакции. Выделяемые слизистой оболочкой β-дефензины, кателицидин, адреномедуллин, а также антимикробный белок кальпротектин дополняют защитную функцию антимикробных факторов слюнных желез, лизоцима, иммуноглобулинов и гистатинов.
Характеристика АМП ротовой полости
Дефензины (от англ. defense — оборона, защита и лат. -in (e) — суффикс, обозначающий «подобный») — семейство катионных пептидов длиной 18—45 аминокислотных остатков и содержащих 6—8 остатков цистеина. Пространственная белковая структура дефензинов содержит антипараллельные β-слои и стабилизирована тремя дисульфидными мостиками. Наличие дисульфидных связей повышает устойчивость дефензинов к лейкоцитарным и микробным протеазам в очаге воспаления [8].
Дефензины активны против грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов, а также против многих вирусов. Как правило, дефензины присоединяются к внешней клеточной мембране микроба и углубляются в нее, формируя порообразные разрывы (рис. 2) [3].
Рис. 2. Механизм антимикробного действия дефензинов.
Нарушение барьерной функции мембраны приводит к гибели микробной клетки. Мишенью для положительно заряженных дефензинов являются отрицательно заряженные молекулы фосфатидилглицерола, которыми богаты мембраны бактерий. Наличие в мембранах клеток хозяина большого количества молекул фосфатидилхолина, несущего значительный положительный заряд, препятствует присоединению дефензинов к клеткам макроорганизма [3].
В дополнение к антимикробным свойствам дефензины активируют факторы хемотаксиса и иммуномодуляторы [8]. Часть дефензинов синтезируется конститутивно, а образование других молекул повышается в ответ на инфекцию или активный синтез провоспалительных цитокинов.
На основании структурных отличий дефензины разделяются на два семейства: α-дефензины, образующиеся преимущественно в нейтрофилах, и β-дефензины, синтезируемые клетками эпителия.
У человека α-дефензины впервые были выделены T. Ganz и соавт. [9] из нейтрофилов, поэтому их также называют «пептиды нейтрофилов человека» (human neutrophil peptides, HNP). Нейтрофилы, мигрируя через эпителий в десневую борозду, обеспечивают защиту зубодесневого соединения от патогенов.
В настоящее время охарактеризовано шесть групп α-дефензинов. Из них четыре группы (HNP-1—4) образуются в нейтрофилах, а еще две выделены из клеток Пеннета и обозначаются HD5 и HD6 (от Human Defensin). Все HNP организма человека выделяются из гранул нейтрофилов до созревания и дифференцировки клеток. Пептиды HNP-1 и HNP-3 состоят из 30 аминокислотных остатков. Они идентичны друг другу за исключением замены аланина на аспарагин. HNP-2 состоит из 29 аминокислот и получается в результате отщепления первой аминокислоты от HNP-1 и HNP-3. В меньших количествах, чем другие пептиды нейтрофилов, образуется HNP-4 [8].
Несмотря на сходство аминокислотной последовательности, каждый из α-дефензинов обладает уникальным спектром антимикробной активности. Например, HNP-3 высокоэффективен против Porphyromonas gingivalis, вызывающих поражение тканей пародонта [10].
α-Дефензины обладают выраженной антивирусной активностью, при этом предполагается, что они могут взаимодействовать как с вирусными частицами, так и с вирусинфицированными клетками. Так, HNP-1—3 оказывают угнетающее действие на вирусы герпеса, гриппа, гепатита С, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)-1, цитомегаловирусы, папилломавирусы, аденовирусы [11].
Поскольку HNP формируют каналы в мембране и могут попадать в клетку, они дают и разнообразные внутриклеточные эффекты. Показано, что они могут ингибировать синтез нуклеиновых кислот и белка [8].
A. Higazi и соавт. [12] показали, что α-дефензины, связываясь с плазминогеном, препятствуют распространению инфекции. Кроме того, α-дефензины также способствуют активации фагоцитоза. При снижении продукции интерлейкина (ИЛ)-10 моноцитами HNP-1—3 усиливают синтез фактора некроза опухоли-α (ФНО-α) и ИЛ-1, что очень важно для развития локальной воспалительной реакции. В работах S. Van Wetering и соавт. [13] показано, что α-дефензины усиливают адгезию Т-лимфоцитов к эпителиоцитам. Конкурируя за связывание адренокортикотропного гормона с рецепторами α-дефензины ингибируют синтез глюкокортикоидов. Также α-дефензины могут усиливать или подавлять активацию классического пути системы комплемента [8].
Продукция HNP-1—3 увеличивается при хронических воспалительных процессах в тканях ротовой полости, что может объясняться двойственной ролью α-дефензинов в развитии иммунного ответа, а также разбалансированностью защитных реакций [8]. В исследованиях M. Puklo и соавт. [14] выявлено, что в десневой жидкости при хроническом пародонтите уровень HNP-1—3 повышается в 60 раз, а при остром в 15 раз.
α-Дефензины участвуют в поддержании целостности эпителия полости рта. Так, HNP в низких дозах усиливают пролиферацию и дифференцировку эпителиальных клеток, а HNP-1—3 еще и являются индукторами синтеза муцинов [15].
Количество HNP изменяется при различных системных патологиях, а уровень их секреции влияет на течение заболевания [8, 16]. Так, повышенная выработка α-дефензинов у ВИЧ-положительных пациентов замедляет развитие болезни, а при более низком уровне наблюдается усиление патологического процесса [17].
β—Дефензины образуются во всех эпителиальных клетках человека. Они синтезируются слизистыми оболочками ротовой полости, десен, языка, а также слюнными железами. По строению β-дефензины похожи на α-дефензины, но их полипептидная цепь больше на 36—44 аминокислотных остатка. Они, как и α-дефензины, являются катионными пептидами. Из известных в настоящее время изоформ β-дефензинов человека (hBD) четыре детально охарактеризованы и названы hBD-1, hBD-2, hBD-3 и hBD-4 [3]. Ранее в полости рта человека были выделены только три первых изоформы [18], а позднее из эпителия десны — hBD-9 [19].
Изоформы β-дефензинов hBD-1 и hBD-2 синтезируются дифференцированными эпителиальными клетками, а hBD-3 экспрессируется в недифференцированных эпителиальных клетках базального слоя эпителия. В отличие от других эпителиальных клеток, где синтез hBD-2 активируется только при воспалении, в ротовой полости hBD-1 и hBD-2 синтезируются постоянно. Предполагается, что образование hBD-2 происходит в ответ на микрофлору, присутствующую в полости рта в норме, что, вероятно, с одной стороны поддерживает иммунную систему в состоянии «боевой готовности», а с другой — регулирует развитие микрофлоры. Образование hBD-3 в эпителии десны индуцируется микробной инфекцией или воспалительными цитокинами [7].
Q. Lu и соавт. [20, 21] выявили значительное повышение синтеза hBD-2 и hBD-3 при гингивите и пародонтите. Образование этих β-дефензинов в эпителиальных клетках увеличивается под действием ИЛ-1β и ИЛ-17, ФНО-α. H. Conti и соавт. [22] выявили индукцию синтеза β-дефензинов под действием ИЛ-17 в ответ на появление на поверхности слизистой оболочки полости рта грибков рода Candida. В настоящее время считается, что hBD-1 контролирует рост нормальной микрофлоры, предотвращая возникновение оппортунистических инфекций, тогда как hBD-2 и hBD-3 обеспечивают защиту от болезнетворных агентов [7].
β-Дефензины играют важную роль в антивирусной защите. В работах Z. Feng и соавт. [26] продемонстрировано, что синтез hBD-2 и hBD-3 в клетках эпителия десны у взрослых людей подавляет ВИЧ. Показано, что β-дефензины, присоединяясь к рецептору CXCR-4 Т-лимфоцитов, инактивируют его путем эндоцитоза. Так как данный рецептор необходим для инфицирования Т-лимфоцитов ВИЧ, β-дефензины являются одним из первых механизмов защиты от ВИЧ-инфекции [26].
Также β-дефензины выполняют функции связывающего звена между врожденным и приобретенным иммунитетом, так как могут служить факторами хемотаксиса для многих иммунных клеток. Это свойство β-дефензинов проявляется в более низкой концентрации, чем необходимо для антимикробного действия. Функции изоформ β-дефензинов проявляются по-разному: hBD-1 активируют незрелые дендритные клетки и Т-клетки памяти; hBD-2 привлекают тучные клетки и нейтрофилы; hBD-3 является хемоаттрактантом для нейтрофилов, дендритных клеток, тучных клеток и моноцитов; hBD-2 и hBD-3 индуцируют дегрануляцию тучных клеток, что может способствовать развитию аллергической реакции [3].
Участвуя в регуляции иммунного ответа, β-дефензины оказывают влияние на синтез хемокинов различными клетками. Под их воздействием в кератиноцитах вырабатываются белок хемотаксиса моноцитов-1, интерферон-γ-индуцируемый белок-10, белок 3α воспаления макрофагов, что ведет к усилению иммунного ответа. С другой стороны, β-дефензины ингибируют выработку ФНО-α и ИЛ-6, тем самым снижая воспалительную реакцию и иммунный ответ [27].
Имеются данные, что β-дефензины принимают участие в процессе заживления ран. В зоне повреждения синтез hBD-3 кератиноцитами стимулируется факторами ростами иммунных клеток, такими как инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1), α-трансформирующий фактор роста (ТФР-α) и фактор роста эпителия (ФРЭ) [3]. Можно предположить, что это является дополнительной защитой поврежденного участка от внедрения болезнетворных агентов.
Кателицидины — это семейство АМП, обнаруженных у различных живых организмов. Единственный кателицидин человека носит название LL-37, так как он состоит из 37 аминокислотных остатков и содержит два остатка лейцина на N-конце.
Синтез LL-37 начинается с образования крупного предшественника, который затем подвергается ограниченному протеолизу под действием эластазы или протеиназы-3. При нейтральных значениях рН пептид LL-37 заряжен положительно, и более половины его аминокислотных остатков неполярны. В водном растворе LL-37 образует беспорядочный клубок, но формирует α-спираль при встраивании в двойной слой липидов биологических мембран. Способность образовывать α-спираль, по-видимому, и определяет антимикробную активность данного пептида [28].
Механизм антимикробного действия кателицидина человека отличается от такового дефензинов. Предполагается, что LL-37 покрывает мембрану наподобие ковра и разрушает ее аналогично детергентам с образованием множества мицелл, как это показано на рис. 3 [3].
Рис. 3. Механизм антимикробного действия кателицидина человека (LL-37).
Экспрессируется LL-37 в эпителиальных клетках дыхательных путей, пищеварительного и урогенитального трактов, а также в полости рта. В смешанную слюну человеческий кателицидин выделяется нейтрофилами и, в меньшей степени, эпителиальными клетками. Показано, что при воспалении синтез LL-37 происходит в клетках эпителия десны, языка, слизистой оболочки щек [7]. I. Hosokawa и соавт. [29] установили, что наиболее высокая концентрация LL-37 определяется на дне десневой борозды.
Синтез человеческого кателицидина в различных клетках регулируется факторами роста и дифференцировки и зависит от присутствия микроорганизмов. Так усиливают экспрессию LL-37 фактор роста ИФР-1 и витамин D [7]. Исследования O. Turkoglu и соавт. [30] показали, что при пародонтите имелось значительное повышение уровня кателицидина человека, которое не наблюдалось при гингивите.
LL-37 проявляет антимикробную активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий, включая возбудителей пародонтита P. gingivalis и A. actinomycetemcomitans, которая сохраняется в слюне даже в присутствии протеиназы P. gingivalis [3]. M. Inomata и соавт. [31] установили, что кателицидин снижает развитие воспалительной реакции в ответ на внедрение P. gingivalis в десну человека.
Кателицидин LL-37 является хемоаттрактантом для иммунных клеток и вызывает миграцию нейтрофилов, моноцитов и Т-клеток в участок воспаления. Некоторые исследователи считают, что человеческий кателицидин является «сигналом тревоги», и основная его функция — активация антиген-презентирующих клеток [3].
LL-37 играет важную и сложную роль в канцерогенезе, и его действие отличается тканеспецифичностью. Повышенная экспрессия человеческого кателицидина связана с возникновением или прогрессом многих злокачественных образований, таких как рак молочной железы, рак яичников и рак легких. С другой стороны, есть данные, что он препятствует развитию рака желудка [32]. В клетках рака легких LL-37 активирует сигнальные пути MARK (от англ. mitogen-activated protein kinase — митогенактивируемая протеинкиназа), что приводит к повышению скорости пролиферации и неограниченному росту клеток опухоли [7].
В защите эпителия от внедрения микроорганизмов важную роль играет слизь. В клетках кишечного эпителия LL-37 усиливает экспрессию генов, кодирующих муцины, тем самым увеличивая толщину слизистого слоя. Данные о действии LL-37 на синтез муцина в ротовой полости отсутствуют, но сообщалось, что муцины слюны снижают антимикробную активность этого АМП [33].
Гистатины (Hsts) — катионные пептиды слюны, одной из функций которых является защита от патогенных грибов. Гистатины получили свое название благодаря наличию остатков гистидина и могут быть названы «пептиды, богатые гистидином». Гистатины секретируются околоушными и поднижнечелюстными железами. Семейство гистатинов включает 12 пептидов длиной от 7 до 38 аминокислот, из которых Hst-1 и Hst-3 являются отдельными полноразмерными пептидами, закодированными в различных рядом расположенных генах. Остальные представители семейства имеют меньший размер и получаются путем частичного протеолиза из Hst-1 и Hst-3. Под действием протеиназ слюны Hst-2 образуется из Hst-3 и Hst-1, а остальные гистатины Hst-4−12 — из Hst-3. В наиболее высокой концентрации в слюне обнаружен Hst-5 [34].
Гистатины активны против патогенных дрожжевых и нитчатых грибов, в том числе и резистентных к азолам и полиеновым антимикотикам. Антибактериальные свойства гистатинов выражены значительно слабее, чем противогрибковые. Наиболее подробно изученный Hst-5 обладает высокой активностью в отношении дрожжевого гриба C. albicans, который является представителем нормальной микрофлоры полости рта, но может вызывать поражение слизистой оболочки полости рта у иммунодефицитных пациентов. Hst-5 предотвращает переход бластоспор C. albicans в стадию псевдогиф, что защищает ткани от проникновения гриба [35]. Уровень гистатинов у пациентов с рецидивирующим кандидозом полости рта повышен по сравнению со здоровыми добровольцами, что, по-видимому, предотвращает развитие инвазионных форм грибковой инфекции. Снижение уровня синтеза гистатинов с возрастом коррелирует с увеличением частоты грибковых инфекций полости рта. Одной из причин развития грибковых инфекций полости рта у больных ксеростомией может быть именно недостаточность гистатинов. Особая роль гистатинов в предотвращении кандидоза полости рта недавно была продемонстрирована в работах S. Khan и соавт. [36], которые показали, что у ВИЧ-инфицированных пациентов со сниженным уровнем Hst-5 в слюне наблюдается массированное размножение C. albicans на слизистой оболочке ротовой полости. Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что гистатины поддерживают рост C. albicans и другой грибковой микрофлоры полости рта на определенном физиологическом уровне.
Несмотря на детальные исследования, механизм антимикробного действия гистатинов до сих пор до конца не изучен. Ясно только, что Hst-5 имеет несколько внутриклеточных мишеней и механизмов действия. При обработке культуры C. albicans Hst-5 гибель микроорганизма наступает в результате осмотического дисбаланса из-за потери ионов калия. В водном растворе гистатин-5 образует беспорядочный клубок, но формирует α-спираль в липидном бислое мембран. Ранее считалось, что действие Hst-5 реализуется через образование пор и нарушение проницаемости биологической мембраны, но последующие исследования показали, что данный механизм не объясняет антигрибковую активность этого гистатина в физиологических условиях. Однако можно предположить, что при высоких концентрациях в эксперименте или при использовании гистатинов в качестве лекарственных средств их действие будет приводить к нарушению барьерной функции биологических мембран микроорганизмов. Показано, что Hst-5 может проникать в клетку C. albicans тремя различными путями: простой или облегченной диффузией с помощью мембранного транспортера, а также эндоцитозом [37]. Тот или иной способ транспорта зависит, по-видимому, от концентрации Hst-5. Возможно, что и формирование α-спирали в двойном слое липидов мембран способствует проникновению гистатина в клетку.
Многочисленные исследования показали, что действие Hst-5 на клетки C. albicans приводят к выходу из них макроэрга аденозинтрифосфата (АТФ). Предполагается, что гибель клеток гриба происходит не только из-за потери АТФ, но и благодаря особому механизму клеточной сигнализации. Высвободившиеся молекулы АТФ, вероятно, взаимодействуют с определенными рецепторами на внешней клеточной мембране, что запускает каскад реакций, приводящий к гибели клеток [35]. Основной мишенью для Hst-5 в клетке гриба являются митохондрии. В митохондриях клеток C. albicans, обработанных Hst-5, наблюдается изменение в составе ферментов дыхательной цепи и цикла трикарбоновых кислот. Считается, что один из механизмов действия Hst-5 связан с окислительным стрессом, который обусловлен нарушением функций митохондрий. Вследствие окислительного стресса происходит нарушение функций других клеточных компонентов. Также показано нарушение клеточного цикла C. albicans под влиянием Hst-5, которое коррелирует с потерей объема клеток [35].
В последнее время появились доказательства, что возможным механизмом действия гистатинов является конкурирование с патогенами за ионы железа, меди, цинка и других металлов [37]. Данная гипотеза согласуется с предыдущими исследованиями, которые показали, что комплексы Hst-5 с металлами могут усиливать окислительный стресс. Кроме того, связывание ионов железа и меди внутри клетки может нарушать работу митохондрий, так как ионы этих металлов входят в состав белковых комплексов дыхательной цепи. В любом случае изменение количества ионов металлов может пагубно влиять на жизнедеятельность клеток C. albicans. Предложенные механизмы действия Hst-5 на клетку C. albicans суммированы на рис. 4 [35].
Рис. 4. Воздействие гистатина-5 на клетку C. albicans. А — проникновение гистатина-5 в клетку; Б — воздействие на митохондрию; В — выход АТФ из митохондрий и из цитоплазмы наружу; Г — АТФ взаимодействует с рецепторами на мембране и запускается клеточная гибель; Д — образование активных форм кислорода (АФК); Е — воздействие на ядро, нарушение клеточного цикла; Ж — связывание ионов металлов.
Гистатины участвуют в формировании защитной пелликулы на поверхности зубов, что предотвращает развитие зубного налета и препятствует деминерализации эмали [35]. Недавние эксперименты M. Oudhoff и соавт. [38] показали, что гистатины 1 и 2 стимулируют миграцию эпителиальных клеток, что, по-видимому, способствует заживлению ран в ротовой полости.
На основании изучения влияния замены аминокислотных остатков на свойства Hst-5 были синтезированы два антимикробных пептида, обладающие очень высокой антимикробной активностью, однако их клиническое применение оказалось невозможным из-за гемолитической активности in vivo [35].
Адреномедуллин относится к регуляторным пептидам широкого спектра действия. Впервые адреномедуллин был выделен K. Kitamura и соавт. [39] из клеток феохромоцитомы, и свое название получил, так как был обнаружен среди пептидов мозгового вещества надпочечников. Сейчас известно, что адреномедуллин синтезируется клетками печени, почек, эпителия кожи, кишечника, полости рта. Нарушения его синтеза были обнаружены при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, печени, почек, гестозе второй половины беременности (преэклампсия) [28].
Адреномедуллин состоит из 52 аминокислотных остатков. Синтез адреномедуллина происходит путем частичного протеолиза из более крупного предшественника преадреномедуллина. На С-конце пептидного остова имеется остаток амидированного тирозина. Адреномедуллин имеет области гомологии с кальцитонином, поэтому его относят к кальцитониновому семейству [3].
В клетках полости рта адреномедуллин экспрессируется постоянно, а под воздействием бактериальных липополисахаридов, ИЛ-1 и ТФР-α, его синтез возрастает [3].
В полости рта адреномедуллин подавляет развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, но не обладает антигрибковой и антивирусной активностью [3]. Показана его высокая активность в отношении возбудителя пародонтита P. gingivalis.
Кроме антимикробного действия адреномедуллин существенно влияет на гемодинамику, вызывая расширение периферических кровеносных сосудов. Кроме того, адреномедуллин участвует в эндокринной регуляции: тормозит выделение АКТГ из гипофиза, воздействует на секреторную активность коры надпочечников, а также секрецию инсулина [3].
Механизм антимикробного действия адреномедуллина точно не известен, но есть предположение, что он, как и большинство АМП, нарушает барьерную функцию биологических мембран [3].
Патологические состояния, вызванные изменением количества АМП
Системные нарушения при отсутствии одного из АМП при некоторых наследственных патологиях сопровождаются развитием заболеваний тканей полости рта [16, 40]. Так, синдром Папийона-Лефевра, характеризующийся ранним пародонтитом и множественным кариесом зубов, возникает вследствие мутации в гене катепсина С. Как предполагают S. de Haar и соавт. [41] недостаток катепсина приводит к нарушению частичного протеолиза кателицидина, что необходимо для образования активного АМП LL-37. При болезни Костманна (наследственная нейтропения) снижается продукция нейтрофилами α-дефензинов. Данное заболевание сопровождается развитием пародонтита в раннем возрасте. K. Putsep и соавт. [16] было показано, что состояние пародонта не улучшается даже после введения нейтрофилов в ходе медикаментозного лечения. Авторы предполагают, что поражение тканей полости рта при данной патологии связано с дефицитом α-дефензинов и кателицидина LL-37.
Перспективы практического использования АМП полости рта
В связи с тем что АМП полости рта разнообразны и действуют на микроорганизмы очень быстро, вероятность развития резистентности к ним достаточно мала. Это позволяет надеяться, что АМП могут использоваться для получения антимикробных препаратов, устойчивость к которым развивается очень медленно. Поэтому предлагается применение АМП, обладающих антивирусной и противогрибковой активностью, у лиц с ослабленным иммунитетом, в том числе, больных СПИДом, для профилактики и лечения кандидозов и герпетических гингивостоматитов.
Представляется перспективным использование АМП для профилактики и лечения гингивита и пародонтита. Существует предположение, что применение АМП может остановить прогрессирование этих заболеваний. С этой целью предлагается использование АМП в составе гелей, полосканий или аппликаций для местного применения.
В настоящее время на основе кателицидина свиньи создан лекарственный препарат Изеганан (Iseganan), который успешно применяется при лечении мукозитов слизистой оболочки полости рта, возникающих у онкологических больных на фоне химиотерапии [42, 43].
Гистатин Hst-5 является идеальным кандидатом в качестве компонента противогрибковых препаратов для лечения заболеваний полости рта: с одной стороны, он обладает активностью, сопоставимой с синтетическими азолами и полиеновыми антимикотиками, а с другой — является натуральным компонентом человеческой слюны, что снижает риск негативных реакций на его применение [35]. Кроме того, отличие механизма действия гистатинов от антимикотиков, используемых в клинике, делает перспективным их применение при развитии резистентности микоспор к препаратам медицинского назначения. В настоящее время исследования по разработке синтетических аналогов гистатинов остаются актуальными.
Было предложено применять Hst-5 в качестве противогрибкового средства в составе лечебных гелей и паст, искусственной слюны и акриловых съемных зубных протезов. В работах D. Paquette и соавт. [44] применяли гели с гистатинами для профилактики развития гингивита и зубного налета, которые хорошо переносились волонтерами. Введение гистатинов в базис съемных зубных протезов и других материалов, из которых изготавливаются зубные протезы, несомненно, представляется полезным, так как противогрибковые свойства гистатинов будут препятствовать колонизации грибов на поверхности зубного протеза. Эксперименты, проведенные в этом направлении, были признаны успешными [45].
И, наконец, АМП могут быть использованы в качестве биомаркеров для диагностики и прогноза заболеваний полости рта. Так как индивидуальные различия в составе слюны и десневой жидкости весьма значительны, то для диагностики предполагается использовать панели, позволяющие определять целый спектр факторов воспаления [46]. Показано, что при воспалительных заболеваниях тканей полости рта изменяется продукция адреномедуллина, β-дефензинов 1, 2, 3, 4А; кателицидина LL-37, α-дефензинов HNP-1—3. Комплексная диагностика этих АМП наряду с другими факторами воспаления, вероятно, позволит сформировать более полное представление о состоянии пародонта [28, 46].
Все авторы в равной степени принимали участие в подготовке материала.