Что значит противовирусная активность in vitro
Противовирусная активность in vitro и разработка оптимального режима дозирования гидроксихлорохина в лечении тяжёлого острого респираторного синдрома, вызванного SARS-CoV-2
Тяжёлый острый респираторный синдром, вызванный коронавирусом SARS-CoV-2, впервые зарегистрирован у пациентов в г. Ухань (Китай) и затем распространился по всему миру. Для лечения инфекции, вызванной Covid-19, использовался противомалярийный препарат хлорохин.
Гидроксихлорохин обладает тем же механизмом действия, что и хлорохин, но его более благоприятный профиль безопасности делает его предпочтительным препаратом для лечения малярии и аутоиммунных заболеваний.
Исследователи предположили, что иммуномодулирующий эффект гидроксихлорохина также может быть полезен для контроля гиперцитокинемии (цитокинового шторма, цитокинового каскада), возникающего в поздней фазе у пациентов с инфекцией SARS-CoV-2 в критическом состоянии. В настоящее время нет никаких доказательств, подтверждающих целесообразность применения гидроксихлорохина при инфекции SARS-CoV-2.
Фармакологическая активность хлорохина и гидроксихлорохина была изучена с использованием инфицированной вирусом SARS-CoV-2 культуры клеток Vero. Физиологически обоснованное фармакокинетическое моделирование (physiology-based pharmacokinetic PBPK) было реализовано для обоих препаратов отдельно путём интеграции их данных in vitro. Используя модели PBPK, для изучения наиболее эффективного режима дозирования с учётом профиля безопасности препарата были симулированы концентрации гидроксихлорохина в лёгочной жидкости при 5 различных режимах дозирования.
Было обнаружено, что гидроксихлорохин (50% эффективная концентрация EC50=0,72 мкМоль) обладает большей активностью по сравнению с хлорохином (EC50=5,47 мкМоль) in vitro. Основываясь на результатах моделей PBPK, для лечения инфекции SARS-CoV-2 рекомендуется нагрузочная доза гидроксихлорохина сульфата 400 мг 2 раза в день внутрь, а затем поддерживающая доза 200 мг 2 раза в день в течение 4 дней, поскольку при использовании данного режима достигается трёхкратная эффективность хлорохина фосфата при приеме 500 мг два раза в день в течении 5 дней заранее.
Таким образом, результаты данного исследования продемонстрировали, что гидроксихлорохин более активен, чем хлорохин, в ингибировании in vitro коронавируса SARS-CoV-2.
Yao X., Ye F., Zhang M., Cui C., Huang B., Niu P., Liu X., Zhao L., Dong E., Song C., Zhan S., Lu R., Li H., Tan W., Liu D.
In Vitro Antiviral Activity and Projection of Optimized Dosing Design of Hydroxychloroquine for the Treatment of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2).
Clin Infect Dis. 2020 Mar 9. pii: ciaa237. doi: 10.1093/cid/ciaa237.
коронавирус, коронавирусная инфекция, Covid-19, SARS-CoV-2, хлорохин, гидроксихлорохин
Активность антибактериальных средств in vitro
Грамотрицательные неферментирующие микроорганизмы широко распространены в окружающей среде. Одной из серьезных проблем является диагностика вызванных ими инфекций, связанная с объективными трудностями их выделения и идентификации. Второй проблемой является то, что для них характерна полирезистентность к антимикробным препаратам, включая те, которые обычно активны против Pseudomonas aeruginosa.
В данном исследовании определялась антибактериальная активность in vitro различных препаратов по отношению к 177 выделенным в клинике штаммам неферментирующих бактерий (кроме Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp.). МПК определялась методом разведений в агаре. Использовали среду Мюллера-Хинтона. Оценивали активность ампициллина, пиперациллина, пиперациллин/тазобактама, сульбактама, цефоперазона, цефоперазон/сульбактама, цефтазидима, цефепима, азтреонама, имипенема, меропенема, колистина, гентамицина, амикацина, триметоприм/сульфаметоксазола, хлорамфеникола, эритромицина, рифампицина, норфлоксацина, ципрофлоксацина и миноциклина.
У 7 изолятов: Sphingobacterium multivorum(2), Sphingobacterium spiritivorum(1), Empedobacter brevis(1), Weeksella virosa(1), Bergeyella zoohelcum(1) и Oligella urethralis (1), вместо чувствительности к цефоперазону или сульбактаму определяли чувствительность к амоксициллин/клавуланату и ампициллин/сульбактаму.
Полирезистентность к антибактериальным препаратам была характерна для таких возбудителей, как Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Chryseobacterium spp., Myroides spp., Achromobacter xylosoxidans и Ochrobactrum anthropi.
В то же время, такие микроорганизмы, как Pseudomonas stutzeri, Shewanella putrefaciens-algae, Sphingomonas paucimobilis, Pseudomonas oryzihabitans, Bergeyella zoohelcum, Weeksella virosa и Oligella urethralis часто были чувствительны к большинству из тестируемых антибиотиков.
Учитывая, что различные виды возбудителей, образующих группу грамотрицательных неферментирующих микроорганизмов, демонстрируют различные показатели антибиотикорезистентности, для выбора оптимальной схемы лечения требуется проведение микробиологического исследования с идентификацией возбудителя и выявления показателей его антибиотикорезистентности. Феномен полирезистентности, характерный для ряда возбудителей, требует активной разработки новых антибактериальных средств или поиска новых комбинаций антибиотиков, обладающих синергизмом бактерицидного действия по отношению к данным микроорганизмам.
«In vitro» activity of different antimicrobial agents on Gram-negative nonfermentative bacilli, excluding Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. (Vay C.A., Almuzara M.N., Rodriguez C.H., Pugliese M.L., Lorenzo Barba F., Mattera J.C., Famiglietti A.M. Rev. Argent Microbiol., 2005;37(1):34-45).
Код вставки на сайт
Активность антибактериальных средств in vitro
Грамотрицательные неферментирующие микроорганизмы широко распространены в окружающей среде. Одной из серьезных проблем является диагностика вызванных ими инфекций, связанная с объективными трудностями их выделения и идентификации. Второй проблемой является то, что для них характерна полирезистентность к антимикробным препаратам, включая те, которые обычно активны против Pseudomonas aeruginosa.
В данном исследовании определялась антибактериальная активность in vitro различных препаратов по отношению к 177 выделенным в клинике штаммам неферментирующих бактерий (кроме Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp.). МПК определялась методом разведений в агаре. Использовали среду Мюллера-Хинтона. Оценивали активность ампициллина, пиперациллина, пиперациллин/тазобактама, сульбактама, цефоперазона, цефоперазон/сульбактама, цефтазидима, цефепима, азтреонама, имипенема, меропенема, колистина, гентамицина, амикацина, триметоприм/сульфаметоксазола, хлорамфеникола, эритромицина, рифампицина, норфлоксацина, ципрофлоксацина и миноциклина.
У 7 изолятов: Sphingobacterium multivorum(2), Sphingobacterium spiritivorum(1), Empedobacter brevis(1), Weeksella virosa(1), Bergeyella zoohelcum(1) и Oligella urethralis (1), вместо чувствительности к цефоперазону или сульбактаму определяли чувствительность к амоксициллин/клавуланату и ампициллин/сульбактаму.
Полирезистентность к антибактериальным препаратам была характерна для таких возбудителей, как Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Chryseobacterium spp., Myroides spp., Achromobacter xylosoxidans и Ochrobactrum anthropi.
В то же время, такие микроорганизмы, как Pseudomonas stutzeri, Shewanella putrefaciens-algae, Sphingomonas paucimobilis, Pseudomonas oryzihabitans, Bergeyella zoohelcum, Weeksella virosa и Oligella urethralis часто были чувствительны к большинству из тестируемых антибиотиков.
Учитывая, что различные виды возбудителей, образующих группу грамотрицательных неферментирующих микроорганизмов, демонстрируют различные показатели антибиотикорезистентности, для выбора оптимальной схемы лечения требуется проведение микробиологического исследования с идентификацией возбудителя и выявления показателей его антибиотикорезистентности. Феномен полирезистентности, характерный для ряда возбудителей, требует активной разработки новых антибактериальных средств или поиска новых комбинаций антибиотиков, обладающих синергизмом бактерицидного действия по отношению к данным микроорганизмам.
Об изучении противовирусной активности отдельных пробиотических штаммов лакто- и бифидобактерий во ФБУН ННИИЭМ им.академика И.Н.Блохиной Роспотребнадзора
В настоящее время у мирового научного сообщества вызывает высокий интерес вопрос взаимодействия пробиотических бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium с вирусами, в связи с использованием их для профилактики и лечения вирусных инфекций.
Учеными ФБУН ННИИЭМ им.академика И.Н.Блохиной Роспотребнадзора была изучена противовирусная активность шести производственных пробиотических штаммов – L. plantarum 8 RA 3, L. fermentum 39, L. fermentum 90 TC-4, B. bifidum 1, B. bifidum 791 и B. longum 379, составляющих микробную основу жидких пробиотических БАД к пище группы LB-комплекс («LB-комплекс», «LB-комплекс Л», «LL-комплекс»), разработанных и выпускающихся в институте (свидетельства о государственной регистрации RU.77.99.88.003.E.000946.01.15, RU.77.99.88.003.E.002522.06.18; RU77.99.88.003.R.003638.10.19).
Сотрудниками Нижегородского НИИЭМ были проведены работы по изучению взаимодействия штаммов L. plantarum 8 RA 3 и L. fermentum 39 с ротавирусами. Установлено, что клетки L. fermentum 39 способны адсорбировать на себе ротавирусные частицы, что позволяет научно обосновать новый аспект применения пробиотиков, включающих данный штамм, при острых гастроэнтеритах, вызванных ротавирусами человека.
Результаты проведенных исследований оформлены в научную статью, которая опубликована в журнале «Микробиология»: Соловьева И.В., Новикова Н.А., Точилина А.Г., Белова И.В., Кашников А.Ю., Сашина Т.А., Жирнов В.А., Молодцова С.Б. Пробиотический штамм Lactobacillus fermentum 39: биохимические свойства, особенности генома, антивирусная активность // Микробиология. – 2021. – Т. 90, № 2. – С. 215–222. DOI: 10.31857/S0026365621020142 (Web of Science Core Collection Q3).
Сотрудниками Нижегородского НИИЭМ, совместно с учеными ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (г. Новосибирск) был проведен анализ полного генома пробиотических штаммов L. plantarum 8 RA 3, L. fermentum 90 TC-4, L. fermentum 39, B. bifidum 791, B. bifidum 1, B. longum 379 и изучение их активности в отношении вирусов высокопатогенного гриппа А – A/Lipetsk/1V/2018 (H1N1 pdm09) (EPI_ISL_332798), A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6) (EPI_ISL_336925) и вируса SARS-CoV-2 штамм Australia/VIC01/2020 (GenBank: MT007544.1). В результате было подтверждено, что противовирусная активность является штаммоспецифичным признаком и установлено, что штаммы L. fermentum 39, L. fermentum 90 TC-4 и B. bifidum 791 проявляют выраженную активность против вирусов гриппа А в клетках MDCK. Активность против вируса SARS-CoV-2 была продемонстрирована только штаммом L. fermentum 90 TC-4 в клетках VERO. Таким образом, было доказано, что штаммы L. fermentum 39, L. fermentum 90 TC-4 и B. bifidum 791 обладают выраженной противовирусной активностью, а пробиотики, содержащие эти штаммы, могут использоваться для профилактики заболеваний, вызываемых ротавирусами, вирусами гриппа А и вирусом SARS-CoV-2.
Содержащие эти штаммы лекарственные средства и БАД к пище целесообразно использовать в комплексных программах лечения и реабилитации больных с вирусными инфекциями. Результаты проведенных исследований оформлены в совместную научную статью, которая опубликована в зарубежном журнале «Biomed Research International» Soloveva I.V., Ilyicheva T.N., Marchenko V.Yu., Pyankov O.V., Tochilina A.G., Belova I.V., Zhirnov V.A., Bormotov N.I., Skarnovich M.O., Durymanov A.G., Molodtsova S.B., Filippova E.I., Ovchinnikova A.S., Magerramova A.V., Ryzhikov A.B., Maksyutov R.A. Genome Features and In Vitro Activity against Influenza A and SARS-CoV-2 Viruses of Six Probiotic Strains // BioMed Research International. – 2021. – V. 2021. – ID 6662027, 11 p. https://doi.org/10.1155/2021/6662027. https://www.hindawi.com/journals/bmri/2021/6662027/. (Web of Science Core Collection Q3, Scopus Q2).
В настоящее время продолжается совместная работа ФБУН ННИИЭМ им.академика И.Н.Блохиной Роспотребнадзора и ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (г. Новосибирск) по изучению противовирусной активности производственно-перспективных пробиотических штаммов лактобацилл, выделенных от здоровых людей различных возрастных групп, из коллекции Нижегородского НИИЭМ против рота-, норовирусов, высоко патогенных вирусов гриппа и различных геновариантов вируса SARS-CoV-2.
Если Вы не нашли необходимую информацию, попробуйте
зайти на наш старый сайт
Разработка и продвижение сайта – FMF
Почтовый адрес:
Адрес: 350000, г. Краснодар, ул. Рашпилевская, д. 100
Канцелярия +7 (861) 255-11-54
прием посетителей пн., вт., ср., чт. с 10.00 до 16.00
ПТ. и предпраздничные дни с 10.00 до 13.00
перерыв с 13.00 до 13.48
Изучение противовирусной активности Ингавирина в отношении возбудителя «мексиканского» пандемического гриппа А/H1N1/2009 in vitro и in vivo
Изучена и доказана высокая противовирусная эффективность Ингавирина ® in vitro и in vivo в сравнении с препаратом контроля Арбидолом ® в отношении «мексиканского» пандемического вируса гриппа A/H1N1/2009, штаммы А/Саliforniа/04/ 2009(H1N1) и A/California/07/2009(H1N1), при лечебном и профилактическом способе применения.
Study of Ingavirin ® Antiviral Activity against Mexican Pandemic Influenza Virus A/H1N1/2009 in vitro and in vivo
S. Ya. Logi Nova, S. V. Borisevich, V. N. Shchukina, M. V. Lykov, G. V. Borisevich, V. P. Bondarev, V. E. Nebolsin, 0. A. Sutochnikova, A. G. Chychalin
Virusological Centre, Branch of Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad
Valenta Farm, Moscow
Research Institute of Pulmonology, Moscow
High in vitro and in vivo efficacy of Ingavirin ® against the Mexican pandemic influenza virus A/H1H1/2009. strains A/California/ 04/2009 (M1N1) and A/California/07/2009 (H1N1) vs. the reference drug Arbidol ® was studied and verified when used therapeutically and prophylactically.
Key words: influenza virus A (H1N1), Infavirin, antiviral activity.
В августе 2010 года Всемирная организация здравоохранения объявила о завершении пандемии гриппа A/H1N1/2009, в результате которой произошло замещение сезонного вируса гриппа A(H1N1) новым пандемическим возбудителем гриппа A(HlNl)-2009 [1]. Установившаяся циркуляция возбудителя гриппа A(HlNl)-2009 в сезон 2010/2011 гг. наравне с распространением вирусов гриппа A(H3N2) и В [2] обосновывает актуальность изучения эффективности нового отечественного противовирусного препарата Ингавирин ® в отношении «мексиканского» пандемического вируса гриппа A/H1N1/09.
К настоящему времени стратегия отбора эффективных неспецифических медицинских средств защиты для многих вирусных инфекций описана в руководствах по доклинической оценке лекарственных средств [3,4].
Ранее была показана противовирусная эффективность in vitro и in vivo нового отечественного химиопрепарата Ингавирин ® в отношении эпидемически и предпандемически значимых подтипов H3N2, H5N1 вируса гриппа типа А, вируса гриппа В и аденовируса 11. Кроме того, была показана эффективность Ингавирина ® в отношении возбудителя пандемического гриппа A/H1N1/09 в культуре клеток MDCK [12]. На втором этапе исследований необходимо было провести оценку эффективности препарата на лабораторных животных и завершить исследования в культуре клеток.
Целью представленной работы являлась оценка эффективности Ингавирина ® in vitro и in vivo в отношении «мексиканского» пандемического вируса гриппа A/H1N1/09.
Монослой клеток MDCK инфицировали вирусом гриппа А при температуре 37°С в течение 60 мин в дозе 0,001 ЦПД50 Оценку цитопатической активности вируса в присутствии и отсутствии химиопрепаратов проводили с использованием светового микроскопа. Исследуемый препарат вносили спустя 1 час после инфицирования монослоя.
Исследуемый препарат. Ингавирин ® производства ОАО «Валента Фарм», Россия.
Препарат сравнения. Арбидол ® производства ЗАО «Фармстандарт», Россия.
Титрование возбудителя гриппа А. Биологическую активность оценивали титрованием вируссодержащей суспензии в РКЭ (lg ЭИД50/мл) и по ЦПД в культуре клеток MDCK.
Оценка противовирусной эффективности Ингавирина ® осуществлена в соответствии с официальными требованиями [4]. Изучение активности Ингавирина ® в отношении вируса гриппа А проводили на белых мышах, инфицированных интраназально в дозе 1,1х10 3 ИД50. Препарат вводили по профилактической (за 5 суток до инфицирования, ежедневно однократно в дозе 5 мг/кг) и лечебной (через 24 ч после инфицирования и далее в течение 5 суток однократно в дозе 15 мг/кг) схемам.
Препарат контроля Арбидол ® вводили в дозах и схемах в соответствии с Инструкцией по его медицинскому применению с учётом равноэквивалетности доз для человека.
Основными критериями оценки эффективности in vitro являлись:
— коэффициент ингибирования гемагглютинирующей активности (Ки, %);
— коэффициент подавления цитопатической активности вируса (%).
Основным критерием оценки эффективности препаратов in vivo являются показатели уровня ингибирования формирования специфического гемагглютинина и уровня накопления вируса в легких белых мышей на 5 и 7 сутки после инфицирования (Ки, % и Δ, lg).
Таблица 1.
Подавление цитопатического действия вируса гриппа A/H1N1/09 препаратами в культуре клеток MDCK (n=3)
Таблица 2.
Подавление образования специфического гемагглютинина вируса гриппа A/H1N1/09 препаратами в культуре клеток MDCK (n=3)
Таблица 3.
Подавление накопления вируса гриппа, штамм A/California/07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при профилактическом и лечебном применении препаратов
| Препарат | Схема введения | Доза препарата, | 5 сутки после заражения | 7 сутки после заражения | ||
| Уровень гемагглютинина, ГА, ед., X±σх | Коэффициент ингибирования формирования специфического гемагглютинина в легких, X±σх, процент | Уровень гемагглютинина, ГА, ед., X±σх | Коэффициент ингибирования формирования специфического гемагглютинина в легких, X±σх, процент | |||
| Ингавирин ® | Профилактическая | 5 | 6,7±1,3 | 89,6±2,1 | 4,0±0,0 | 83,4±4,2 |
| Арбидол ® | 30 | 16,0±0,0 | 75,0±0,0 | 5,3±1,3 | 79,2±4,1 | |
| Контроль без препарата | — | — | 64,0±0,0 | — | 26,7±5,3 | — |
| Ингавирин ® | Лечебная | 15 | 5,3±1,3 | 89,6±2,1 | 4,0±0,0 | 83,4±4,2 |
| Арбидол ® | 130 | 21,3±5,3 | 58,3±8,3 | 5,3±1,2 | 79,2±4,1 | |
| Контроль без препарата | — | — | 53,3±10,6 | — | 26,7±5,3 | — |
Таблица 4.
Накопление вируса гриппа, штамм A/California/07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при профилактическом применении препаратов
| Препарат | Доза препарата, мг/кг | Изучение биопроб на. сутки после заражения | Уровень накопления вируса в легких, lgЭИД50/мл, X±σх | Снижение уровня накопления вируса, Δ, lg, X±σх | Коэффициент ингибирования накопления вируса, %, X±σх |
| Ингавирин ® | 5 | 5 | 3,6±0,1 | 3,0±0,1 | 99,9±0,0 |
| Арбидол ® | 30 | 4,8±0,1 | 1,9±0,1 | 98,6±0,2 | |
| Контроль без препарата | — | 6,6±0,1 | — | — | |
| Ингавирин ® | 5 | 7 | 3,6±0,1 | 2,8±0,1 | 99,8±0,1 |
| Арбидол ® | 30 | 5,0±0,2 | 1,4±0,2 | 95,5±2,8 | |
| Контроль без препарата | — | 6,4±0,1 | — | — |
Таблица 5.
Накопление вируса гриппа, штамм A/California/07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при лечебном применении препаратов
| Препарат | Доза препарата, мг/кг | Изучение биопроб на. сутки после заражения | Уровень накопления вируса в легких, lgЭИД50/мл,X±σх | Снижение уровня накопления вируса, Δ, lg, X±σх | Коэффициент ингибирования накопления вируса, %, X±σх |
| Ингавирин ® | 15 | 5 | 6,1±0,2 | 2,5±0,1 | 99,6±0,2 |
| Арбидол ® | 130 | 6,0±0,1 | 2,6±0,1 | 99,8±0,0 | |
| Контроль без препарата | — | 8,6±0,1 | — | — | |
| Ингавирин ® | 15 | 7 | 5,3±0,2 | 2,1±0,02 | 99,1±0,1 |
| Арбидол ® | 130 | 6,4±0,1 | 1,0±0,1 | 90,4±1,8 | |
| Контроль без препарата | — | 7,4±0,1 | — | — |
Таким образом, результаты изучения эффективности Ингавирина ® по подавлению репродукции вируса в лёгких белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/Калифорния/07/2009(НШ1), выявили, что препарат эффективно подавляет накопление возбудителя в органе-мишени на 5 и 7 сутки после инфицирования при использовании его как по схеме профилактики, так и по схеме лечения [5, 6, 8, 9, 13].
1. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Минздрав РФ, 2000.
2. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Минздрав РФ, 2005.
3. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение лечебной эффективности нового отечественного химиопрепарата Ингавирин ® в отношении возбудителя гриппа A (H3N2). Антибиотики и химиотер 2008; 7-8: 27-30.
4. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение профилактической эффективности нового отечественного препарата Ингавирин ® в отношении возбудителя гриппа A (H3N2). Там же 2008; 11-12: 19-21.
5. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение эффективности Ингавирина ® in vitro в отношении возбудителя аденовирусной инфекции. Там же 2009; 7-8: 16-18.
6. Колобухина Л. В., Малышев Н. А., Меркулова Л. Н. и др. Изучение эффективности и безопасности нового противовирусного препарата Ингавирин ® при лечении больных гриппом. Русс мед журн 2008; 22: 1-5.
7. Колобухина Л. В., Малышев Н. А., Меркулова Л. Н. и др. Эффективность Ингавирина ® в лечении гриппа у взрослых. Тер архив 2009: 3: 54-57.
8. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение противовирусной активности Ингавирина ® в отношении возбудителя гриппа A (H3N2) in vitro. Антибиотики и химиотер 2009; 9-10: 23-26.
9. Галегов Г. А., Андронова В. Л., Небольсин В. Е. Изучение противовирусной активности Ингавирина ® в отношении сезонного вируса гриппа A(H1N1) в культуре клеток MDCK. Там же 2010; 9-10: 19-22.
10. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Лыков М. В. и др. Изучение эффективности Ингавирина ® in vitro в отношении «мексиканского»пандемического подтипа H1N1 вируса гриппа А, штаммы А/California/04/2009 и штаммы A/California/07/2009. Там же 2009; 3-4: 15-17.
11. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Шкляева О. М. и др. Изучение профилактической и терапевтической эффективности нового отечественного химиопрепарата Ингавирин ® в отношении возбудителя гриппа A (H5N1). Там же 2010; 7-8: 10-12.
Изучение противовирусных свойств мирамистина in vitro в отношении вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов
Герпетическая инфекция, обусловленная вирусом простого герпеса (ВПГ) 1-го и 2-го типов, занимает одно из ведущих мест по распространенности среди вирусных заболеваний. У большинства здоровых людей ВПГ-1 и ВПГ-2 вызывают широкий спектр заболеваний, причем как острую первичную инфекцию, так и рецидивирующие заболевания кожи и слизистых оболочек. У новорожденных и лиц с иммунодефицитами инфекция может протекать особенно тяжело и заканчиваться летальным исходом. Для профилактики и терапии инфекции ВПГ предложено много средств, однако препаратами выбора остаются нуклеозидные аналоги (например, ацикловир), которые обладают селективной антигерпесвирусной активностью, обусловленной подавлением репликации вируса и инактивацией вирусной ДНК-полимеразы. С 1982 г. стали регистрироваться штаммы ВПГ, устойчивые к действию ацикловира (АЦВ), а за последние 10 лет, когда АЦВ стал основным противогерпетическим средством, частота выделения таких штаммов резко возросла, особенно от иммунокомпрометированных лиц [1]. По данным разных авторов, АЦВ-резистентные штаммы ВПГ встречаются в 4–14% случаев у онкологических больных, ВИЧ-инфицированных и лиц, перенесших трансплантацию органов и тканей или получающих длительную иммуносупрессивную терапию. В этой связи актуальной задачей является поиск и изучение новых противогерпетических средств с альтернативным механизмом противовирусного действия.
Препарат Мирамистин® (мирамистин) из группы катионных антисептиков широко используется для индивидуальной профилактики заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП), в том числе герпесвирусной инфекции (ГИ), а также для лечения бактериальных и грибковых осложнений у больных ЗППП. Имеются данные об успешном применении мирамистина при лечении воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей и легких различной этиологии. Сообщалось, что мирамистин проявляет антимикробную активность в отношении бактерий, грибов, простейших, а также обладает иммуномодулирующим и регенерирующим действиями, способностью повышать неспецифическую резистентность организма. Имеются данные о противовирусном действии мирамистина в отношении ретровирусов (ВИЧ), парамиксовирусов (корь, паротит) и некоторых других [2, 3]. Обнаружено, что мирамистин проявляет активность на ранних этапах инфекционного процесса; в основе его действия лежит предотвращение адсорбции и пенетрации вируса в клетки хозяина. Учитывая, что механизм противовирусного действия мирамистина отличается от действия АЦВ, можно предположить, что использование мирамистина для профилактики и комплексной терапии ГИ позволило бы снизить не только частоту появления штаммов ВПГ, резистентных к действию ацикловира и его аналогов, но и снизить распространенность вируса среди лиц групп риска, а также повысить эффективность противогерпетического лечения.
После полного формирования в лунках планшета монослоя клеток Vero B (в течение 24 ч) ростовую среду удаляли, клетки троекратно отмывали средой Игла и вносили в лунки в составе поддерживающей среды мирамистин (в максимально переносимых и меньших концентрациях) по одной из нижеприведенных схем. Противовирусную активность препаратов (ПАП) оценивали общепринятыми методами по их способности предотвращать развитие индуцируемого вирусами цитопатического действия (ЦПД) и ингибировать репродукцию вирусов в культуре клеток, а также по наличию вирулицидного действия [4–6]. Для профилактики герпесвирусной инфекции широко применяются вирулицидные препараты, оказывающие непосредственное разрушающее действие на вирусные частицы (например, оксолиновая мазь). Оценку вирулицидного действия проводили для того, чтобы выяснить, посредством какого механизма мирамистин проявляет свою активность в отношении вируса простого герпеса: подавления репродукции вируса или в результате разрушения (повреждения) им вирусных частиц.
Схема 1 (оценка цитотоксического действия препарата на неинфицированные клетки): различные концентрации препарата вводили в состав поддерживающей среды, которой покрывали сформировавшийся монослой. Планшеты инкубировали в течение 96 ч, как указано выше. Действие препарата оценивали ежедневно методом световой микроскопии по степени изменения морфологии клеточного монослоя.
Определяли ТЦД50 препарата, которая соответствовала концентрации, вызывающей видимые нарушения морфологии у 50% клеток монослоя, и максимально переносимую концентрацию (МПК) – наиболее высокую дозу препарата, не вызывающую видимых изменений клеточного монослоя, по сравнению с контролем. Для дальнейшего исследования применяли концентрации препаратов, не превышающие МПК.
Схема 2 (определение прямого вирулицидного действия препарата на вирионы ВПГ): в течение 1 ч инкубировали суспензии штаммов ВПГ-2 или ВПГ-1 в присутствии различных концентраций препарата мирамистин в среде Игла, при 37 °С в атмосфере с 5% СO2 с последующим титрованием суспензии в культуре клеток. Инокулюмы из серийных разведений (101–106) вносили в лунки планшета с монослоем, планшеты инкубировали 1 ч при 37 °С в атмосфере с 5% СO2, затем суспензию вируса удаляли, клетки троекратно отмывали средой Игла и вносили в лунки свежую питательную среду, после чего планшеты инкубировали 96 ч в тех же условиях.
Схема 3 (оценка ранней профилактической активности): внесение препарата за 1 ч до инфицирования клеток. В лунки планшета с отмытым монослоем вносили питательную среду, содержащую мирамистин в указанных концентрациях, и инкубировали, как описано выше. Через 1 ч в лунки планшета вносили суспензию вируса и инкубировали в течение 1 ч. Затем суспензию вируса удаляли, в лунки вносили питательную среду, не содержащую препарат, и планшеты инкубировали, как описано выше, в течение 96 ч.
Схема 4 (оценка экстреннопрофилактической активности): внесение препарата через 1 ч после инфицирования клеток. Клетки инкубировали в обычных условиях. В лунки планшета вносили суспензию вируса и инкубировали 1 ч. Затем в лунки планшета вносили питательную среду, содержащую мирамистин в указанных концентрациях, и клетки инкубировали, затем среду с несвязавшимися вирусами удаляли и вносили в лунки питательную среду, содержащую препарат в тех же концентрациях. Через 15 мин действие препарата останавливали внесением в каждую лунку по 100 мкл ЭТС, планшеты помещали в термостат и выдерживали в тех же условиях в течение 96 ч.
Схема 5 (оценка поздней профилактической активности): внесение препарата через 12 ч после инфицирования клеток. В лунки планшета с отмытым монослоем вносили суспензию вируса и инкубировали в течение 12 ч. Затем суспензию вируса удаляли и вносили в лунки питательную среду, содержащую препарат в указанных концентрациях. Через 15 мин действие препарата останавливали внесением в каждую лунку по 100 мкл ЭТС, планшеты помещали в термостат и выдерживали в течение 96 ч в указанных выше условиях.
Противовирусную активность препарата оценивали по 50% ингибиторной концентрации (ИК50), то есть минимальной концентрации препарата, при которой ЦПД вируса уменьшалось наполовину по сравнению с контролем.