Что означает слово секвенирование
Секвенирование
Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности (от лат. sequentum — последовательность). В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов (next-generation sequencing) и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК, получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и даже полных геномов организмов. [1] [2]
Для секвенирования применяют методы Эдмана, Сэнгера и другие; в настоящее время для секвенирования генов обычно применяют метод Сэнгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить, при помощи ПЦР. Секвенирование полного генома обычно осуществляют при помощи технологий next-generation sequencing.
Содержание
Секвенирование по Сэнгеру
Дезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. При секвенировании по Сенгеру происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3′-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице.
Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех 2′,3′-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается.
В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.
В более современном варианте дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определённом месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Современные приборы используют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез. [3]
Как секвенируют ДНК
Секвенирование ДНК в последние десятилетия превратилось из узкой области, которой занималось небольшое число ученых, в одну из самых стремительно развивающихся технологий. Рост производительности и падение стоимости даже опережают закон Мура, и, из-за большой конкуренции на рынке и огромного спроса, развитие и дальше будет идти высокими темпами. Кроме того, развитие секвенирования привело к такому же буму в биоинформатике и коренным образом изменило биологию, и, постепенно, также основательно меняет медицину.
По катом я подробнее рассказываю, как это делают.
Что такое ДНК
Для начала, чтобы понимать сам процесс, немного необходимой теории.
ДНК — это полимерная цепь, состоящая из мономеров четырех типов, называемых нуклеотидами, последовательность которых и кодирует информацию об организме. Иначе говоря, ДНК можно представить как текст, написанный четырехбуквенным алфавитом. ДНК — молекула, состоящая из двух цепочек, и, хотя, последовательность нуклеотидов у них разная, последовательность одной цепочки можно однозначно восстановить, если известна последовательность другой. Поэтому цепочки называют комплементарными. (англ. Complement – дополнение) Это свойство используется при копировании клетки, когда цепочки ДНК расплетаются, и, на каждой, как на матрице, синтезируется вторая, и каждая из двух дочерних клеток получает свою двуцепочечную ДНК. Вся последовательность ДНК организма называется геномом. Например, геном человека состоит из 46 хромосом.
Несмотря на большое количество разнообразных, как экспериментальных, так и устаревших методов, мейнстримовые коммерческие методы довольно похожи, и, чтобы не делать оговорки каждый раз, сразу скажу, что речь дальше будет идти именно об этих мейнстримовых методах.
Как это выглядит в общем
Перед описанием технологии секвенирования, для интуитивного понимания, проведу следующую аналогию: стопку одинаковых газет взрывают так, что они разлетаются на небольшие кусочки с отрывками текста, а, затем, каждый из этих кусочков читают и, из этих прочтений восстанавливают текст первоначальной газеты.
Чтобы секвенировать ДНК, сначала ее выделяют из исследуемого образца, затем режут на небольшие фрагменты случайным образом, фрагменты называются ридами. От каждого рида оставляют по одной цепочке, и на этой цепочке, как на матрице, синтезируют вторую, причем, тип каждого следующего присоединяющегося нуклеотида как-то детектируют. Таким образом, записывая последовательность присоединившихся нуклеотидов, восстанавливают их последовательность в каждом риде. Затем, из последовательностей ридов с помощью компьютерных программ реконструируют геном.
Важный момент. Суммарная длина ридов должна многократно превышать длину исследуемой ДНК. Делается это потому, что, когда ДНК выделяют из образца, и когда ее режут, часть ее теряется, так что никто не гарантирует, что каждый ее участок попадет хотя бы в один рид. Поэтому, чтобы каждый участок гарантированно был бы прочтен, ДНК берут с большим запасом. Кроме того, при секвенировании возможны ошибки, и, чтобы более надежно прочитать ДНК, каждый ее участок следует прочитать несколько раз.
ДНК разрезают на риды, которые читают, и из них восстанавливают первоначальную последовательность
Такая методика используется не от хорошей жизни. Она добавляет множество трудностей, и, если бы исследователи могли взять и прочитать за раз целую последовательность генома, то они были бы счастливы, однако, это на данный момент невозможно.
У этого есть 2 причины. Первая — это ошибки, происходящие при чтении каждого нуклеотида. Они постепенно накапливаются, и, каждый следующий нуклеотид читается хуже предыдущего, и, в какой-то момент качество чтения настолько снижается, что дальше продолжать процесс бессмысленно. У разных методов секвенирования длина рида, которы они могут хорошо прочитать, составляет порядка десятков или сотен нуклеотидов. Вторая заключается в том, что ДНК — это очень длинная молекула, и, при скрупулезном чтении каждой буквы друг за дружкой, секвенирование заняло бы неприлично много времени, а в данном случае этот процесс легко распараллеливается, и можно одновременно читать миллионы и миллиарды ридов.
Illumina
Такая схема в общих чертах описывает все популярные методики секвенирования. Различаются они лишь методами детекции присоединившихся нуклеотидов при синтезе, и методикой подготовки материала.
На сегодняшний день самым распространенным является метод, который используется в секвенаторах компании Illumina. В этом методе сначала множество различных ридов прикрепляется к стеклянной пластине. Затем, с каждого рида делают множество копий на поверхности пластины так, чтобы на каждом ее небольшом участке располагались лишь одинаковые копии. Это делается для того, чтобы при последующем секвенировании получать сигнал не от одиночной молекулы, а от группы одинаковых молекул, располагающихся рядом. Так и сигнал легче считывать, и надежность считывания увеличивается. Эти молекулы являются одноцепочечными ДНК, и на них в процессе секвенирования синтезируются комплементарные цепи. Реакцию синтеза проводят следующим образом: К началу каждой молекулы присоединяется по одному нуклеотиду. Этот нуклеотид химически блокирован так, что после его присоединения синтез дальше не идет. Кроме того, к нему присоединена метка, которая под действием лазера люминесцирует. Причем, для каждого типа нуклеотидов цвет люминесценции разный. После присоединения нуклеотида пластину освещают лазером и фотокамера фиксирует цвета, которыми люминесцирует пластина. После этого блокировку снимают, метку также снимают, и присоединяют таким же образом следующий нуклеотид. Последовательность световых сигналов на каждом участке пластины в компьютере переводится в последовательность нуклеотидов, и, на выходе получается файл, содержащий последовательности ридов.
Секвенирование по методу Illumina
1 — геномная ДНК 2 — разрезается на риды 3 — к ридам прикрепляются адаптеры, с помощью которых они приклеиваются на 4 — пластину 5 — размножение ридов на пластине 6 — засовывам в секвенатор и 7 — секвенируем
Сборка и аннотирование генома
Если геномы близких организмов раньше не секвенировались, то из ридов, затем, с помощью программ, пытаются собрать единую последовательность нуклеотидов. Риды частично перекрываются, и, с помощью этих перекрытий пытаются выстроить единую последовательность. Здесь есть множество моментов, которые существенно осложняют дело. Например, можно загрязнить образец, и программа будет пытаться выстроить одну последовательность из ДНК разных организмов. Секвенатор может ошибиться при чтении рида, или неверно связать два места в геноме, потому что они очень похожи. На самом деле, сложностей так много, что всех тут не перечислишь. И, некоторые из них настолько сложно поддаются устранению, что, даже геном человека, самый важный и широко исследуемый геном, все еще не секвенирован до конца.
риды и внизу последовательность генома, которая реконструирована на их основе
Когда последовательность генома собрана, то нужно понять, что она значит. На ней находят участки, которые похожи на гены. Делается это следующим образом: В начале и конце генов находятся определенные «метки» из нуклеотидов, и, если на ДНК находят такие последовательности на таком растоянии, что между ними может уместиться ген, то такое место заносится в список потенциальных генов. Затем, этого претендента сравнивают с базой данных уже известных генов других организмов, и, если в ней находят ген, достаточно сильно похожий на этот участок, то ему присваивают функцию этого гена.
Если геном другого организма этого вида уже секвенировался, то его используют, для сборки. Так как геномы разных организмов одного вида различаются лишь незначительно, то для каждого рида находят место на секвенированном геноме, к которому он ближе всего, и на основе этого генома собирают новый.
КЛИНИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ
Самый современный метод диагностики наследственных заболеваний.
Точные методы диагностики:
Что такое секвенирование
Секвенирование — это метод определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК. Тестирование используется для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК, которые являются причиной наследственных болезней, наследственных предрасположенностей или особенностей организма. Существует несколько разновидностей секвенирования, которые позволяют выявлять возможные генетические отклонения и редкие генетические варианты, тонко влияющие на появление определенных патологий в человеческом организме.
Показания к проведению анализа с помощью метода секвенирования:
Для получения более подробной информации об исследовании вы можете позвонить по телефону:
либо воспользоваться консультацией врача-генетика
Основные этапы исследованияя
Вне зависимости от типа секвенирования процедура делится на несколько основных этапов:
Таргетное секвенирование
Возможности таргетного секвенирования
Метод таргетного секвенирования позволяет выделять и исследовать конкретные области геномов или отдельные гены. Технологии нового поколения позволяют рассчитывать время и затраты на исследование. Таргетному анализу могут подвергаться отдельные интересующие пациента гены, участки генов и митохондриальные ДНК.
Преимущества таргетного секвенирования
По сравнению с комплексными методами анализа таргетное секвенирование более выгодно. Исследуются лишь отдельные участки генов, в которых могут определяться мутации. В таком случае для диагностики требуется меньше ресурсов, поэтому таргетный поиск отдельных отклонений обойдётся гораздо дешевле, нежели полная диагностика.
Панели генов
Таргетные панели были разработаны в отношении групп заболеваний, объединенных какими-то общими симптомами, например, аутизм, задержка психического развития, онкологические заболевания и т.д. К примеру, если в истории семьи обнаруживаются признаки одного или нескольких различных наследственных опухолевых заболеваний, то семья вполне может быть носителем опухолевого наследственного заболевания. Панель “наследственный рак” объединяет серию генетических мутаций, которые могут приводить к наследственному раку. В некоторых случаях наиболее эффективной может оказаться первоначальная проверка при помощи таргетных панелей нового поколения, таких как CancerNext, с целью добиться полного покрытия задействованных генов.
Мультигенные панели
Группа исследований, предназначенных для диагностики клинически сходных заболеваний. Такие исследования могут включать от 10 до 600 генов. Они могут быть эффективны для уточнения диагноза, дифференциальной диагностики и поиска патогенных мутаций.
Полногеномный анализ
Полногеномное секвенирование дает максимально полный набор данных о структуре генетического материала и позволяет детально оценить все индивидуальные генетические вариации. Секвенатор нового поколения IlluminaNextSeq 500 может определять полную структуру генома человека за 2 дня. Каждый участок генома при этом прочитывается 30 раз для повышения точности полученных данных.
Достоверность диагностики при выборе данного вида анализа повышается, если обследовать всю семью: ребенка и родителей.
Что можно получить при полногеномном секвенировании?
Этот метод позволяет обнаружить целый ряд отклонений.
Когда нужно делать секвенирование генома?
Секвенирование генома проводится в следующих случаях.
Анализ данных
В результате полногеномного секвенирования получается огромный объем данных, который требует специальной обработки. Такая обработка включает несколько этапов.
Секвенирование экзома
Секвенирование экзома – это тест для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК, которые являются причиной наследственных болезней, наследственных предрасположенностей или особенностей организма.
Некоторые нуклеотиды исчезают или наоборот удваиваются или заменяются. Во многих случаях это ведет к неправильному формированию организма. Это может проявляться в виде врожденных пороков или малых аномалий развития, задержке психического развития, аутизме и других формах отклонений.
Ученые считают, что полное секвенирование экзома поможет не только обнаружить болезнь, но и предсказать ход прогрессирования заболевания и вовремя начать необходимое лечение. Выявление наследуемых мутаций также важно для оценки репродуктивных рисков.
Клиническое секвенирование экзома
Полное секвенирование экзома
Этот тест включает в себя глубокий анализ 4800 клинически значимых генов, которые связаны с известными наследственными заболеваниями. Наличие обнаруженных мутаций подтверждается классическим секвенированием по Сэнгеру. При необходимости проводится поиск аналогичных мутаций у родителей.
Цель теста – исследование экзома конкретного пациента. Метод клинического секвенирования экзома подходит для обнаружения точечных мутаций, вставок, делеций, инверсий и перестановок в экзоме. Пациент получает заключение об изменениях, связанных с его заболеванием. В то же время лечащий врач может дополнительно запросить более подробную информацию, включая данные о потенциально патогенных вариантах, локализованных в хорошо изученных областях экзома.
Результаты анализируются и проверяются целой командой специалистов медиков. Отчет об обнаруженных изменениях сопровождается подробными комментариями.
Перед проведением тестирования рекомендуется дополнительная консультация врача-генетика. В таком случае пациент может убедиться в необходимости прохождения того или иного набора тестов. Также в ходе консультации рассказывается о возможных преимуществах и рисках генетического тестирования. Дело в том, что потенциальную опасность может представлять не само тестирование (оно совершенно безвредно для пациента), а информация об обнаруженных в генетическом материале отклонениях. В частности, сведения о врожденной предрасположенности к тому или иному заболеванию обычно не сообщаются лицам, не достигшим совершеннолетия. Каждая лаборатория вырабатывает свою политику поведения в подобных случаях.
Преимущества
Ход анализа
В качестве образца для анализа сдается около 10 мл крови.
Часто задаваемые вопросы
Что включает клиническое секвенирование экзома?
Клиническое секвенирование экзома разделяется на несколько этапов.
Секвенирование: Диагностическое секвенирование экзома (DES) включает секвенирование примерно 20 000 генов. Это отличает его от секвенирования всего генома, поскольку метода нацелен на исследование 1-2% областей генома, кодирующих синтез белков, которые предположительно ответственны за появление примерно 85% от числа известных заболеваний. Целью DES является выявление изменений, которые определяют фенотип пациента.
Анализ и проверка: после завершения секвенирования все полученные данные пропускаются через биоинформационный конвейер и последовательно анализируются коллективом медиков. Для каждой обнаруженной альтерации проводится проверка, является ли она связанной с исследуемыми особенностями фенотипа. Потенциально связанные альтерации отправляются на ко-сегрегационный анализ.
Формирование отчета: каждый отдельный случай проходит несколько уровней медицинской проверки, и только после последней из них формируется отчет. Каждый отчет является специфическим для пробанда (человека, генетика которого исследуется) и включает проверку и анализ в том числе литературных данных. Подготовка отчета может длиться от нескольких дней до нескольких недель в зависимости от сложности исследования.
Доступные варианты секвенирования экзома:
Первый уровень (Клиническое секвенирования): Анализ примерно 4 800 клинически охарактеризованных генов. Полное секвенирование экзома пробанда. Проведение ко-сегрегационного анализа семьи для всех положительных или неоднозначных результатов.
Второй уровень (Полное секвенирование экзома): Анализ всех предоставленных генов с целью проведения поиска новых генов (порядка 20 000 генов по всей базе NCBI RefSeq). Полное секвенирование экзома семейного трио. Семейный ко-сегрегационный анализ для обнаруженных позитивных или неоднозначных результатов. Обязательное требование: минимум три образца от членов семьи. Тестирование на образцах эмбрионов не проводится.
Какие данные входят в отчет?
Общие результаты: положительный, предположительно положительный, отрицательный, неоднозначный.
Первичные сведения могут ограничиваться информацией, напрямую связанной с фенотипом. Это помогает выделить наиболее полезную для диагностики болезни информацию. Дополнительные сведения чаще содержат более подробные данные, относящиеся к экзому в целом, безотносительно связи с фенотипом.
Дополнительные сведения: Они варьируются в зависимости от предпочтений и возраста пациента. Данный отчет обсуждается отдельно. В дополнительные сведения попадают только установленные патогенетические или предположительно патогенетические альтерации. О клинически незначимых и доброкачественных альтерациях не сообщается. Дополнительные сведения передаются только пробанду. Прочие члены семьи не получают отчета с дополнительной информацией, однако носительство может быть предположено на основании результатов пробанда.
Когда следует заказывать таргетное секвенирование (целевая панель генов) вместо полного сквенирования экзома?
Перед тем, как начать клиническое секвенирования экзома, важно определить возможность использования таргетных панелей, которые разработаны в отношении некоторой группы заболеваний, например, аутизм, задержка психического развития и пр. К примеру, если в истории семьи обнаруживаются признаки одного или нескольких различных наследственных опухолевых заболеваний, то семья вполне может быть носителем опухолевого наследственного заболевания.
В таком случае более эффективным подходом может оказаться первоначальная проверка при помощи таргетных панелей нового поколения, таких как CancerNext, с целью добиться полного покрытия задействованных генов, поскольку такая проверка позволяет получить в том числе полностью отрицательный результат и исключить наличие мутаций в основных опухолевых генах.
Можно ли комбинировать секвенирование экзома с проведением иных генетических тестов (к примеру, хромосомным микроматричным анализом) в рамках одного заказа?
Мы рекомендуем вначале делать хромосомный микроматричный анализ, а затем выполнять секвенирование экзома.
Что необходимо предоставить для клинического секвенирование экзома?
Для выполнения секвенирования экзома необходимы:
Принимаются ли для тестирования материалы только пробанда, когда образцы родителей или иных родственников первой степени предоставить невозможно (к примеру, для приемных детей)?
Если для тестирования предоставляются только образцы пробанда либо предоставляется менее трех образцов от родственников первой степени, то можно заказать лишь проведение тестирования первого уровня (FTE).
Есть ли у клинического секвенирования экзома технические ограничения?
Да, ограничения существуют.
Можно ли сделать повторный анализ данных, полученных при секвенировании?
Да, мы предоставляем такую возможность.
Повторный анализ данных без взимания дополнительной платы возможен в течение двух лет после получения образцов.
Можно ли провести полное секвенирование экзома для эмбриональных образцов?
Эмбриональные образцы принимаются только в случае гибели плода. Для эмбриональных образцов доступно тестирование первого уровня (FTE).
Если вариант ДНК был пересмотрен и классифицирован иначе, получит ли врач уведомление об этом, чтобы сообщить обновленную информацию своему пациенту?
Секвенирование экзома в нашей лаборатории предполагает повторную классификацию вариантов. Получение дополнительной информации основанной на больших популяционных исследованиях помогает облегчить интерпретацию и уточнить диагноз. Наша лаборатория, как и все научное сообщество вовлечены в активную работу с целью лучшего понимания человеческого генома. Интерпретации и методы постоянно совершенствуются.
Проверяются ли новые гены?
Новые гены анализируются при условии выбора DES тестирования (клиническая диагностика экзома). Под новыми генами подразумеваются альтерации в генах, которые ранее не связывались с болезнями. В связи со сложностью анализа новых генов, клиническая диагностика экзома (DES) требует больше времени для выполнения заказа по сравнению с тестированием первого уровня экзома (FTE).
Если альтерации в новых генах уже обнаружены и описаны, все усилия направляются на изучение гена, включая координационные исследования и функциональные исследования с группами исследователей, изучающих ген, при наличии таковой возможности.
Предоставляет ли лаборатория полный список вариантов по пациенту?
Да, список предоставляется.
Примечание: не все альтерации из списка вариантов проходят подтверждение другими методами, и потому эти данные должны использоваться лишь в исследовательских целях.
Включает ли проводимое тестирование секвенирование митохондриального генома?
Если было обнаружено, что пациент является носителем мутации (или мутаций), можно ли протестировать членов его семьи?
Да, для членов семьи пациента можно провести односайтовый анализ альтераций, классифицированных как причины болезни.
Родственники первой степени и прочие родственники с тем же фенотипом проверяются в рамках ко-сегрегационного анализа, если соответствующие образцы были получены вместе с образцами пробанда для тестирования.
Биоинформатический анализ экспертного уровня:
Возможен анализ данных, предоставляемых заказчиком. Для уточнения информации свяжитесь с врачом-генетиком.
Биоинформационный анализ включает: