Что относится к фоторецепторам сетчатки

Анатомия

Сетчатка

Сетчатка является внутренней чувствительной оболочкой глаза (tunica interna sensoria bulbi, или retina), которая выстилает полость глазного яблока изнутри и выполняет функции восприятия световых и цветовых сигналов, их первичной обработки и трансформации в нервное возбуждение.

В сетчатке выделяют две функционально различные части – зрительную (оптическую) и слепую (ресничную). Зрительная часть сетчатой оболочки глаза – это большая часть сетчатки, которая свободно прилегает к сосудистой оболочке и прикрепляется к подлежащим тканям только в области диска зрительного нерва и у зубчатой линии. Свободнолежащая часть сетчатки, непосредственно соприкасающаяся с сосудистой оболочкой, удерживается за счет давления, создаваемого стекловидным телом, а также за счет тонких связей пигментного эпителия. Ресничная часть сетчатки покрывает заднюю поверхность ресничного тела и радужки, доходя до зрачкового края.

Слои сетчатки

Сетчатка имеет 10 слоев:

Наружный сегмент фоторецепторов имеет важное значение: именно здесь происходят сложные фотохимические процессы, в ходе которых происходит первичная трансформация энергии света в физиологическое возбуждение. Функциональное назначение колбочек и палочек также различно: колбочки отвечают за цветоощущение и центральное зрение, обеспечивают периферическое зрение в условиях высокой освещенности; палочки обеспечивают зрение в условиях низкой освещенности (сумеречное зрение). В темноте периферическое зрение обеспечивается совместными усилиями колбочек и палочек.

Клетки Мюллера представляют собой гигантские высокоспециализированные, которые проходят чрез все слои сетчатой оболочки, выполняя изолирующую и опорную функции. Клетки Мюллера принимают участие в генерировании биоэлектрических электрических импульсов, активно транспортируя метаболиты. Мюллеровские клетки заполняют узкие щели между нервными клетками сетчатки и разделяют их рецептивные поверхности.

Палочковый путь проведения нервного импульса представлен палочковым фоторецептором, биполярными и ганглиозными клетками, амакриновыми клетками нескольких видов (промежуточными нейронами). Палочковые фоторецепторы контактируют только с биполярными клетками, которые под действием света деполяризуются.

Колбочковый путь проведения нервных импульсов характеризуется тем, что уже в пятом слое (наружный плексиформный слой) синапсы колбочек связывают их с биполярными нейронами различных типов, образуя как световой, так и темновой путь проведения импульса. Благодаря этому колбочки макулярной области формируют каналы контрастной чувствительности. По мере удаления от области макулы количество фоторецепторов, соединенных с множеством биполярных клеток, уменьшается, в то же время число биполярных нейронов, соединенных с одной биполярной клеткой, увеличивается.

Световой импульс активирует превращение зрительного пигмента, запуская возникновение рецепторного потенциала, который распространяется вдоль аксона к синапсу, где вызывает выделение нейромедиатора. Этот процесс приводит к возбуждению нейронов сетчатки, которые осуществляют первичную обработку зрительной информации. Далее эта информация предается по зрительному нерву в зрительные центры головного мозга.

В процессе передачи нервного возбуждения по нейронам сетчатки важное значение имеют соединения из группы эндогенных трансмиттеров, к которым относятся аспартат (специфичен для палочек), глутамат, ацетилхолин (является трансмиттером амакриновых клеток), допамин, мелатонин (синтезируется в фоторецепторах), глицин, серотонин. Ацетилхолин является трансмиттером возбуждения, а гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) – торможения, оба эти соединения содержатся в амакриновых клетках. Тонкий баланс указанных веществ обеспечивает функционирование сетчатки, а нарушение такового может приводить к развитию различных патологий сетчатки (пигментный ретинит, лекарственная ретинопатия и т.п.)

Источник

Анатомия

Палочки и колбочки сетчатки глаза

Палочки сетчатки глаза

Палочки имеют форму цилиндра с неравномерным, но приблизительно равным диаметром окружности по длине. К тому же длина (равная 0,000006 м или 0,06 мм) в 30 раз превышает их диаметр (0,000002 м или 0,002 мм), из-за чего вытянутый в длину цилиндр действительно очень похож на палочку. В глазу здорового человека насчитывается порядка 115-120 миллионов палочек.

Палочка глаза человека состоит из 4 сегментов:

1 — Наружный сегмент (содержит мембранные диски),

2 — Связующий сегмент (ресничка),

3 — Внутренний сегмент (содержит митохондрии),

4 — Базальный сегмент (нервное соединение)

Палочки крайне светочувствительны. Достаточно энергии одного фотона (мельчайшая, элементарная частица света) для реакции палочек. Этот факт помогает при так называемом ночном зрении, позволяя видеть в сумерках.

Достоверно известно, что содержащийся в палочках родопсин реагирует на свет медленнее, чем йодопсин в колбочках. Потому палочки слабее реагируют на динамику светового потока и плохо различают объекты в движении. По этой же причине острота зрения тоже не специализация палочек.

Колбочки сетчатки глаза

Колбочки получили такое название благодаря своей форме, похожей на лабораторные колбы. Длина колбочки равна 0,00005 метра, или 0,05 мм. Ее диаметр в самом узком месте составляет около 0,000001 метра, или 0,001 мм, и 0,004 мм в самом широком. На сетчатке здорового взрослого человека около 7 миллионов колбочек.

Колбочки менее чувствительны к свету, другими словами, для их возбуждения потребуется световой поток в десятки раз интенсивнее, чем для возбуждения палочек. Однако колбочки способны обрабатывать свет интенсивнее палочек, из-за чего они лучше воспринимают изменение светового потока (например, лучше палочек различают свет в динамике при движении объектов относительно глаза), а также определяют более четкое изображение.

Колбочка человеческого глаза состоит из 4 сегментов:

1 — Наружный сегмент (содержит мембранные диски с йодопсином),

2 — Связующий сегмент (перетяжка),

3 — Внутренний сегмент (содержит митохондрии),

4 — Область синаптического соединения (базальный сегмент).

Причиной вышеописанных свойств колбочек является содержание в них биологического пигмента йодопсина. На момент написания этой статьи были найдены (выделены и доказаны) два вида йодопсина: эритролаб (пигмент, чувствительный к красной части спектра, к длинным L-волнам), хлоролаб (пигмент, чувствительный к зеленой части спектра, к средним M-волнам). На сегодняшний день пигмент, который чувствителен к синей части спектра, к коротким S-волнам, не найден, хотя за ним уже закреплено название – цианолаб.

Разделение колбочек на 3 вида (по доминированию в них цветовых пигментов: эритролаба, хлоролаба, цианолаба) носит название трехкомпонентной гипотезы зрения. Однако существует и нелинейная двухкомпонентная теория зрения, приверженцы которой считают, что каждая колбочка одновременно содержит в себе и эритролаб, и хлоролаб, а значит, способна воспринимать цвета красного и зеленого спектра. При этом роль цианолаба принимает на себя выцветший родопсин из палочек. В поддержку этой теории говорит и то, что люди, страдающие дальтонизмом, а именно слепотой в синей части спектра (тританопией), так же испытывают трудности с сумеречным зрением (куриная слепота), что является признаком ненормальной работы палочек сетчатки глаза.

Источник

Зрительный родопсин — рецептор, реагирующий на свет

Родопсин, фоторецептор клеток-«палочек» сетчатки, обесцвечивается при освещении в зависимости от дозы излучения.

Автор

Редактор

Зрение — одно из наиболее удивительных чувств, которым природа наградила человека. С помощью зрения мы получаем огромное количество информации об окружающем мире, можем наслаждаться красотами природы и великими произведениями искусства. За восприятие электромагнитного излучения «видимого диапазона», лежащее в основе зрения, отвечает рецептор белковой природы, содержащийся в фоторецепторной мембране «дисков» клеток сетчатки глаза, — родопсин.

Словарик

Введение

Родопсин — светочувствительный пигмент (хромопротеин) фоторецепторных клеток сетчатки глаза позвоночных — является в настоящее время одним из наиболее изученных мембранных белков. Сетчатка глаза (рис. 1) преобразует свет в нервные сигналы, определяя чувствительность зрения в различных диапазонах освещенности — от звездной ночи до солнечного полдня. Сетчатка образована двумя главными типами зрительных клеток — палочками (около 120 млн. клеток на сетчатку человека) и колбочками (около 7 млн. клеток). Колбочки, сконцентрированные преимущественно в центральной области сетчатки (называемой центральной ямкой), функционируют только при ярком свете и отвечают за цветовое зрение и чувствительность к мелким деталям, а более многочисленные палочки ответственны за зрение в условиях слабой освещенности и отключаются при ярком освещении. (Это является причиной того, что ночью невозможно уверенно различить цвета предметов. Ночью, как известно, «все кошки серы».)

Рисунок 1. Структурные элементы зрительной системы человека. В увеличенном фрагменте сетчатки показано относительное расположение трёх её слоёв. Задний слой сетчатки состоит из длинных и узких клеток фоторецепторов — палочек и колбочек. Средний слой содержит нейроны трёх типов: биполярные, горизонтальные (соединяющие рецепторы и биполярные клетки сравнительно длинными связями, параллельными сетчаточным слоям) и амакриновые клетки. В переднем слое находятся ганглиозные клетки, аксоны которых проходят по поверхности сетчатки, собираясь в пучок, и покидают глаз, образуя зрительный нерв.

Мембраны колбочек содержат три типа рецепторов-опсинов, отвечающих за восприятие света с различными длинами волн, — синего, зеленого и красного пигментов. Аминокислотная последовательность, структура и механизм работы этих белков очень близки к таковым для родопсина, однако тонкие различия в белковом окружении светочувствительного кофактора (ретиналя) приводят к тому, что их спектральные характеристики различаются (рис. 2). В этой статье речь пойдет главным образом о зрительном родопсине, содержащемся в светочувствительных мембранах клеток-палочек.

Рисунок 2. Спектральные характеристики родопсина и трёх других типов опсинов. Цветное зрение приматов трихроматично, то есть определяется тремя типами клеток-«колбочек», содержащих каждая свой тип светочувствительного пигмента, по аминокислотной последовательности и структуре очень схожего с родопсином. На рисунке приведены нормализованные спектры поглощения «синего» (β), «зелено-голубого» (γ) и «жёлто-зеленого» (ρ) пигментов из S-, M- и L-колбочек, соответственно. Также показан спектр родопсина из клеток-«палочек» (обозначен пунктиром).

История изучения родопсина

Открытие родопсина

Пурпурная окраска клеток-палочек была открыта Генрихом Мюллером (Heinrich Müller) в 1851 году, который приписал её гемоглобину. В 1876 году Франц Болл (Franz Boll) заметил, что сетчатка лягушки чувствительна к свету и после освещения меняет свою окраску на жёлтую с последующим обесцвечиванием. Болл также продемонстрировал, что сетчатка приобретает изначальную окраску после некоторого времени, проведенного животным в темноте. Вилли Кюхне (Willy Kühne), продолживший работы Болла, определил, что пигмент, отвечающий за окраску сетчатки — это белок наружных сегментов палочек (НСП), названный им «зрительным пурпуром» (родопсином).

Кюхне выделил родопсин из клеток пигментного эпителия сетчатки, сравнил спектроскопические свойства этого белка и препарата сетчатки, постулировал, что жёлтый и бесцветный продукты, образующиеся под действием света, химически различны и заключил, что генерация сетчаткой электрических импульсов является следствием реакции на свет. Работы Кюхне легли в основу современного понимания молекулярных механизмов зрения.

Ретиналь — светочувствительный кофактор

Джордж Уолд (George Wald) и его коллеги по Гарвардскому университету впервые открыли, что родопсин состоит из двух компонентов — бесцветного белка, называемого опсином или жёлтым пигментом и 11-цис-ретиналя, ковалентно связанного хромофора каротиноидной природы, акцептирующего свет.

В 1933 году Уолд выделил из препарата сетчатки вещество, первоначально идентифицированное как витамин А, что объяснило феномен «куриной слепоты» у пациентов с авитаминозом по этому каротиноиду (к тому времени еще мало было известно о биохимической роли витаминов). Позже оказалось, что кофактором является ретиналь — соответствующий витамину А (ацетату ретинола) альдегид. Уолд и коллеги продемонстрировали, что ретиналь, добавленный в темноте к обесцвеченному родопсину, способен восстанавливать «свежий» пигмент, причём этим действием обладает только 11-цис-изомер. В 1967 году Уолд получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине «за исследования в области физиологии и биохимии зрения», а также за открытие биохимической роли витамина А.

На пути к пространственной структуре родопсина

Полная аминокислотная последовательность родопсина была определена в 1982 году в Институте биоорганической химии АН СССР Ю. А. Овчинниковым и сотр. [3] и несколько позже подтверждена анализом структурного гена родопсина Д. Хоггнесом и Дж. Натансом в США. Было показано, что в последовательности родопсина длиной 348 аминокислотных остатков присутствует семь протяжённых участков, состоящих из неполярных аминокислотных остатков, образующих трансмембранные (ТМ) α-спирали, соединенные вне- и внутриклеточными участками-«петлями». При этом N-конец находится во внеклеточной области, а C-конец — в цитоплазматической. Такая топология рецептора была подтверждена ограниченным протеолизом белка в составе нативной мембраны, обработкой моноклональными антителами и химической модификацией проникающими и непроникающими агентами. Также было установлено место прикрепления кофактора: ретиналь связывается альдиминной связью с остатком ЛИЗ-296, находящимся в седьмой (последней) ТМ α-спирали.

Пространственная структура родопсина долго не поддавалась изучению «прямыми» методами (такими как рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)). В то время как атомная структура другого мембранного белка со схожей семиспиральной топологией — бактериородопсина — была определена Гендерсоном и сотр. еще в 1990-м году [4], структура зрительного родопсина высокого разрешения оставалась неизвестной до 2000 года. Подробнее об этой структуре написано в главе «Структура родопсина».

Родопсин принадлежит к обширному семейству G-белоксопряжённых рецепторов (GPCR-рецепторов), названному так за механизм трансмембранной передачи сигнала, основанный на взаимодействии с внутриклеточными примембранными G-белками. Появление его пространственной структуры, полученной с высоким экспериментальным разрешением, является очень важным событием для биологии и медицины, поскольку родопсин как «родоначальник» семейства А GPCR-рецепторов является своего рода «моделью» структуры и функций множества других рецепторов, чрезвычайно интересных с фундаментальной и практической (фармакологической) точек зрения.

Молекулярная основа зрения

Строение фоторецепторных клеток

Клетки-«палочки» сетчатки (также известные как фоторецепторные клетки) — это высокоспециализированные нейроны, способные реагировать на свет. Особая часть клетки, называемая наружным сегменом палочки (НСП, см. рис. 3а), содержит 1000–2000 мембранных органелл, называемых дисками. Диски уложены в «стопки» (подобно блинам) и располагаются внутри общей с остальными частями клетки плазматической мембраны (рис. 3б). Диски как бы «отпочковываются» от плазматической мембраны, при этом их внутренняя область гомологична внеклеточному пространству (рис. 3в). Наружные сегменты колбочек имеют принципиальное отличие от НСП, заключающееся в том, что диски колбочек представляют собой складки плазматической мембраны (а не самостоятельные органеллы), и их внутреннее пространство сообщается с внеклеточной средой.

Рисунок 3. Строение сетчатки и зрительной клетки-фоторецептора — «палочки». а — Сканирующая электронная микрофотография сетчатки мыши. Палочки составляют

70% из всех (6,4×10 6 ) клеток сетчатки, на долю колбочек приходится

2%. Наружные сегменты палочек (НСП) содержат «диски», мембрана которых обогащена родопсином, а внутренние сегменты (ВС) отвечают за обеспечение клетки энергией и питательными веществами. б — Электронная микрофотография НСП, выделенного из сетчатки мыши. Молярное соотношение между родопсином и фосфолипидами мембраны «дисков» —

1:60; доля других белков в мембране невелика, и их роль в процессе зрения пока остаётся невыясненной. в — Схематичное изображение клетки-палочки. Под действием света проницаемость мембраны НСП для ионов падает, что приводит к гиперполяризации и возникновению нервного импульса. г, д — Квазитопографическое изображение поверхности родопсин-содержащей мембраны диска, полученное с помощью атомно-силовой микроскопии в разном масштабе. Пунктирным овалом обведен димер родопсина, «выбившийся» из рядов, образуемых другими димерами. Считается, что активной формой рецептора, способной к реакции на свет, является именно димер.

а и б — [5], в — [6]

Основной белковый компонент (>90%) фоторецепторных мембран — родопсин, занимающий

50% площади поверхности мембраны дисков (родопсин также присутствует в небольших количествах в плазматической мембране клетки). Мембрана дисков состоит из фосфолипидов (40% фосфатидилхолина, 38% фосфатидилэтаноламина, 13% фосфатидилсерина) и холестерина. Высокая доля ненасыщенных жирных кислот (

80%) делает фоторецепторную мембрану чрезвычайно жидкой, что имеет важное значения для функционирования родопсина.

В фоторецепторной мембране молекулы родопсина образуют димеры (см. главу «Взаимодействие родопсина с G–белком трансдуцином»), располагающиеся рядами (рис. 3г–д). Среднее число молекул родопсина на один диск —

Биохимический каскад зрения

В плазматической мембране НСП позвоночных, не сообщающейся с мембранами дисков, расположены специальные каналы, специфичные для катионов Na + и Ca 2+ и зависящие от циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). В темноте часть этих каналов открыта и названные катионы могут свободно диффундировать из внеклеточного пространства в цитозоль. Этот «темновой ток» ионов, открытый в 1970 году Вильямом Хейгинсом, вызывает деполяризацию плазматической мембраны НСП — «темновая» трансмембранная разность потенциалов НСП составляет

50 мВ вместо обычных для нервной клетки 70 мВ. Как и «обычные» нейроны, палочки вырабатывают медиатор в ответ на деполяризацию, и таким образом получается, что в темноте фоторецепторы постоянно возбуждены и вырабатывают нервный импульс.

В результате поглощения кванта света молекулой родопсина инициируется цепь биохимических событий, следствием которой является закрытие катионных (Na + /Ca 2+ ) каналов, уменьшение темнового тока и гиперполяризация плазматической мембраны (увеличение положительного заряда на внешней поверхности клетки). Свет, повышая разность потенциалов на мембране рецепторной клетки (гиперполяризуя её), уменьшает выделение медиатора, фактически «выключая» рецепторы. При этом эффективность биохимического каскада настолько высока (коэффициент усиления 10 5 –10 6 ), что один-единственный (!) фотон может привести к гиперполяризации и быть зарегистрирован в зрительной коре мозга.

Поглощение родопсином кванта света приводит к ряду его фотохимических превращений, первым этапом которых является фотоизомеризация 11-цис-ретиналя в полностью транс-форму (подробнее об этом и других фотопревращениях родопсина см. в главе «Фотоцикл родопсина»). Изомеризация ретиналя, протекающая за очень короткое время в 200 фс, — единственный светозависимый процесс в зрительном цикле; остальные процессы сопряжены с конформационными перестройками в молекуле родопсина и являются следствием этого первичного акта поглощения света. Наибольшую важность для биохимических реакций, приводящих к возникновению фоторецепторного ответа, представляет один из интермедиатов фотолиза — метародопсин II (максимум на спектре поглощения λ_max=380 нм), который содержит полностью транс-ретиналь и характеризуется значительными конформационными перестройками по сравнению с «темновой» формой родопсина.

Метародопсин II (R*, «световая» или «активированная» форма родопсина R) способен связывать особый G-белок, называемый трансдуцином, передающий возбуждение, сконцентрированное на молекуле трансмембранного рецептора, в жидкую фазу цитоплазмы. Трансдуцин (Т) относится к семейству гетеротримерных G-белков и состоит из трех субъединиц (Т_α, Т_β и Т_γ с массами 40, 37 и 8 кДа соответственно), в первой из которых (Т_α) находится сайт связывания гуанидиновых нуклеотидов ГДФ и ГТФ. В темноте (рис. 4а) Т_α-субъединица содержит связанную молекулу ГДФ и образует комплекс с субъединицами Т_β и Т_γ (функционирующими как димер Т_βγ). Комплекс (Т_α–ГДФ)–Т_βγ имеет высокое сродство к метародопсину II (R*), и после реакции с ним молекула связанного ГДФ обменивается на ГТФ (рис. 4б). Комплекс R*–(Т_α–ГТФ)–Т_βγ быстро диссоциирует на R*, активный компонент Т_α–ГТФ и димер Т_βγ. Освобождённая молекула R* способна катализировать распад еще сотен или даже тысяч трансдуциновых комплексов (рис. 4в), что является первым этапом усиления сигнала в процессе передачи зрительного сигнала (см. также видео).

Активный комплекс Т_α–ГТФ, в свою очередь, активирует следующий белок зрительного каскада — гетеротетрамерную фосфодиэстеразу (ФДЭ) циклического ГМФ (цГМФ). Активация этого белка, локализованного на поверхности мембран дисков, приводит к расщеплению эффекторной молекулы — до трех тысяч молекул цГМФ на одну молекулу активного фермента (рис. 4г) — и инактивации цГМФ-зависимых катионных каналов, приводящей к гиперполяризации плазматической мембраны.

Электрофизиологический эффект фоторецепторной клетки на световой стимул длится в течение сотен миллисекунд, а затем прекращается благодаря специальным механизмам, «выключающим» фосфодиэстеразный каскад и восстанавливающим «темновое» состояние. «Активированная» форма родопсина (R*) трижды фосфорилирована в C-конце (см. главу «Трансмембранная топология»), и имеет сродство к цитоплазматическому белку аррестину, который блокирует взаимодействие с трансдуцином и участвует в десенсибилизации и деградации рецептора. Подробнее об этом механизме см. в статье В.М. Липкина в «Соросовском образовательном журнале» [1].

Фотоцикл родопсина

При поглощении фотона молекула родопсина меняет цвет, что связано с фотоизомеризацией 11-цис-ретиналя в полностью транс-форму и смещением максимума спектра поглощения рецептора с 498 нм до 380 нм (рис. 5). В конце концов, Шиффово основание гидролизуется и полностью транс-ретиналь выделяется в цитоплазматическую среду. Изменение спектральных характеристик родопсина, следующее за поглощением кванта света, объясняется конформационными перестройками, вызванными изомеризацией ретиналя. В большом количестве спектроскопических экспериментов с охлаждением родопсина до очень низких температур был выделен ряд промежуточных его состояний (рис. 5), что позволило охарактеризовать последовательность фотопревращений родопсина следующим образом:

Рисунок 5. Фотоцикл родопсина. Поглощение кванта света с длиной волны, близкой к 500 нм, приводит к чрезвычайно быстрой (200 фс) изомеризации ковалентно связанного хромофора 11-цис-ретиналя в полностью транс-форму. Как следствие, родопсин претерпевает ряд быстрых конформационных перестроек, различимых спектроскопически, и в результате превращается в сравнительно долгоживущий метародопсин-II, или мета-II, существующий в равновесии с мета-I формой. В итоге фотопревращений родопсина, полностью транс-ретиналь выделяется в цитоплазму, восстанавливается до полностью транс-ретинола (при участии ряда ретинол дегидрогеназ) и конвертируется обратно в 11-цис-ретиналь в клетках пигментного эпителия под действием специальных ферментов (так называемый ретиноидный цикл). «Восстановленный» хромофор может спонтанно рекомбинировать с опсином, превращаясь в «темновую» форму родопсина. На рисунке справа от стрелок указаны характерные времена того или иного превращения, а слева — максимальные температуры, при которых фотоинтермедиат удавалось наблюдать in vitro. В скобках указаны максимумы соответствующих спектров поглощения.

В бόльших подробностях с фотопревращениями родопсина можно ознакомиться в [7].

Структура родопсина

Трансмембранная топология

Родопсин — интегральный мембранный белок цилиндрической формы (размеры

75×35×45 Å), трансмембранная (ТМ) часть которого образована «пучком» α-спиралей, уложенных по циклическому принципу в направлении против часовой стрелки (при виде с внеклеточной стороны) и примерно ортогональных плоскости мембраны, причем спираль ТМ3 расположена практически в центре «пучка» (рис. 6). Геометрия многих спиралей отклоняется от «идеальной» (т.е., содержит «изломы»); сильнее всего искажена спираль ТМ6 за счет влияния остатка ПРО-267 (одного из наиболее консервативных во всем семействе GPCR-рецепторов, «родоначальником» подсемейства А которых является родопсин).

Длина аминокислотной последовательности родопсина — 348 остатков, масса белка — около 38 кДа, а длина ТМ спиралей варьирует от 20 до 33 остатков. ТМ домен белка составляет

65% его общей массы, а размеры вне- и внутриклеточных областей примерно равны. Хромофор (ретиналь) связывается в ТМ области белка, ковалентно присоединяясь к остатку ЛИЗ-296.

Внеклеточный домен родопсина образован N-концевым участком, а также «петлями» E-I–E-III, и содержит два сайта гликозилирования по остаткам аспарагина. N-конец и внеклеточная петля II (E-II) содержат пары β-структурных «шпилек» β₁–β₂ и β₃–β₄, причём последние связаны консервативной дисульфидной связью со спиралью ТМ3, как бы «накрывая» сайт связывания ретиналя «крышкой». Цитоплазматический домен образован петлями C-I–C-III и C-концевым участком молекулы. В состав С-конца входит примембранная амфифильная спираль 8, «заякоренная» в мембране двумя остатками пальмитоиловой кислоты, присоединёнными к остаткам цистеина в этой спирали. В C-конце также находится три остатка серина, по которым предположительно происходит фосфорилирование рецептора, связанное с его активацией (рис. 6).

Многочисленные мутагенетические эксперименты позволили выяснить роль некоторых консервативных остатков, находящихся в ТМ области родопсина. Так, консервативный мотив (D/E)R(Y/W), находящийся в цитоплазматическом конце ТМ3, регулирует конформационные перестройки, сопровождающие активацию рецептора. Остаток глутаминовой или аспарагиновой кислоты (ГЛЮ-134 в родопсине) образует солевой мостик с консервативным остатком аргинина, способствуя «удержанию» рецептора в неактивной конформации (мутация кислотной функции этого остатка приводит к получению постоянно активных форм родопсина, не зависящих от влияния света). Протонирование ГЛЮ-134, происходящее при образовании первичного фотоинтермедиата родопсина, приводит к дальнейшим конформационным перестройкам и возникновению мета-II состояния (см. главу «Фотоцикл родопсина»). Другой консервативный мотив, находящийся в цитоплазматическом конце ТМ7 — NPxxY (NPVIY в родопсине, тут “x” обозначает любой остаток) — связывают с образованием комплекса с G-белком трансдуцином.

В целом, практически любой заряженный или полярный остаток, находящийся в ТМ домене, играет свою важную для функционирования и/или создания «архитектуры» рецептора роль. Многие полярные остатки образуют «сети» водородных связей, в которых иногда участвуют молекулы воды, связанные в ТМ домене. Эти системы довольно слабых связей также важны для функционирования такой точно настроенной молекулярной структуры, как рецептор. Причём, полярные остатки ТМ домена, как правило, заглублены в белковое окружение, а «боковую» поверхность рецептора, взаимодействующую с неполярной областью бислойной мембраны, образуют незаряженные и неполярные гидрофобные остатки (рис. 6 б).

Пространственная структура

Пространственная структура родопсина была впервые определена в 2000 году с помощью метода рентгеновской кристаллографии [11], и в последствии несколько раз уточнялась. До сих пор она остаётся единственной трехмерной структурой GPCR-рецептора, экспериментально полученной с высоким разрешением. Структуры других белков этого семейства до сих пор неизвестны, поскольку эти рецепторы очень сложно выделить в необходимом для метода РСА количестве и подобрать условия, в которых белок будет образовывать кристалл, дающий чёткую дифракционную картину. Методу спектроскопии ЯМР такие большие и сложно устроенные мембранные белки пока что недоступны.

В десятилетие, прошедшее с момента получения структуры бактериородопсина (белка со схожим устройством) [4] до появления структуры фоторецептора с высоким разрешением, с помощью метода криоэлектронной микроскопии была получена структура родопсина низкого разрешения [12]. На основе этой структуры с учётом вариабельности аминокислотной последовательности родопсина в различных организмах был предложен «шаблон» расположения C_α-атомов этого рецептора и других рецепторов семейства GPCR [13]. Эти модели показали отличное (по сравнению с бактериородопсином) расположение ТМ спирали 3 (ТМ3) по отношению к другим спиралям, но другие особенности строения родопсина оставались до недавнего времени неизвестными.

Структура родопсина (рис. 7) демонстрирует немного отличающуюся от таковой в бактериородопсине упаковку спиралей: они расположены под бóльшими углами к нормали к мембране, во многих случаях сильнее искажены. Кроме того, ТМ3 почти полностью окружена остальными спиралями, в то время как в бактериородопсине спирали расположены почти точно по эллипсу, в направлении против часовой стрелки при виде с внеклеточной стороны (в родопсине это направление укладки сохраняется).

Рисунок 7. Пространственная структура зрительного родопсина. а — Молекула изображена в виде ленты, обозначающей расположение основной цепи белка. N— и C-концы, а также ТМ спирали подписаны. Показаны боковые цепи двух остатков аспарагина, модифицированные молекулами углеводов, двух остатков цистеина, модифицированных пальмитоиловой кислотой, «заякоривающей» примембранную амфифильную спираль 8 в мембране, а также остатка лизина-296, образующего ковалентную связь с хромофором (структура ретиналя (РЕТ) показана черным цветом внутри полупрозрачной ван-дер-ваальсовой поверхности). Положение мембраны схематично показано жёлтым слоем. Рисунок построен на основе структуры 1U19 из Брукхейвенского банка данных белковых структур (доступны также другие структуры родопсина: 1F88, 1GZM, 1HZX, 1L9H). б — Схематическое изображение остатков, формирующих сайт связывания ретиналя в родопсине (показаны боковые цепи остатков, расположенных не далее, чем на 5 Å от хромофора).

Структурные исследования родопсина помогли установить роль молекул воды, находящихся в ТМ домене рецептора и определить конформации вне- и внутриклеточных петель родопсина. Основываясь на этих исследованиях, были предложены возможные механизмы активации белка и участия функционально важных групп и микродоменов в ТМ передаче сигнала и конформационных перестройках, связанных с поглощением света. Подробнее об этом можно почитать в недавнем обзоре Кристофа Пальцевского (Krzysztof Palczewski) [14], одного из наиболее активных участников упомянутых исследований.

Димеризация родопсина в мембране

С помощью атомно-силовой микроскопии нативных дисковых мембран показано (и подтверждено биохимическими методами), что родопсин образует димеры и даже олигомеры более высокого порядка, выстраивающиеся в «ряды» димеров с вкраплениями олигомеров (см. главу «Строение фоторецепторных клеток», [5], [6]). В настоящее время появляются свидетельства того, что именно димеры родопсина (и других GPCR-рецепторов) являются функционально активными формами [15], но механизм их димеризации и роль этого процесса в работе рецептора пока еще недостаточно хорошо изучены.

Взаимодействие родопсина с G–белком трансдуцином

Взаимодействие активированной формы родопсина с G-белком трансдуцином является ключевым биохимическим аспектом в зрительном процессе (см. главу «Биохимический каскад зрения»). Точный механизм этого процесса неизвестен, поскольку отсутствует структурная информация высокого разрешения об активированной форме родопсина, однако показано, что во взаимодействии с G-белком существенную роль может играть димеризация рецепторов.

Предположительно, с G-белком взаимодействует димер рецептора, одна молекула в составе которого «активирована» и взаимодействует с трансдуцином, а другая может быть неактивной (или даже быть другим GPCR-рецептором) и G-белок не активирует. По данным атомно-силовой микроскопии [6], димер образуется с участием спиралей ТМ4 и ТМ5. Конформационные перестройки, сопровождающие активацию родопсина, приводят к тому, что цитоплазматическая часть рецептора, находящаяся вблизи консервативных мотивов, участвующих в активации родопсина ([D/E]RY в ТМ3 и NPxxY в ТМ7), меняет свое строение. Солевой мостик, связывающий остатки ГЛЮ-134 и АРГ-135, разрушается (что связано с протонированием ГЛЮ-134 и депротонированием Шиффова основания ретиналя в ЛИЗ-296), и петлевые цитоплазматические участки родопсина приобретают сродство к трансдуцину. Схематически предполагаемый процесс взаимодействия родопсина с трансдуцином показан ниже в видео, основанном на биохимических данных и кристаллографических структурах родопсина и субъединиц трансдуцина.

Видео. Возможный механизм взаимодействия родопсина («темновая» форма — синий, «активированная» — жёлтый) с трансдуцином (T_α — оранжевый, T_β — красный, T_γ — зелёный). Молекула ГТФ показана фиолетовым, ГДФ — светло-фиолетовым. Анимация основана на данных атомно-силовой микроскопии [5] и молекулярного моделирования с использованием индивидуальных кристаллографических структур родопсина и трансдуцина [15].

Перспективы исследования родопсина

Структурные исследования родопсина продолжаются, и среди вопросов, ждущих своего разрешения, можно назвать следующие:

Дальнейшее исследование родопсина имеет не только фундаментальное значение и может быть использовано не только для лечения или предотвращения биохимических нарушений зрения. Родопсин — самый разносторонне исследованный белок из семейства GPCR-рецепторов, и закономерности, полученные для него, могут быть использованы для изучения структуры и функциональных особенностей других рецепторов этого семейства. С дисфункцией этих белков связано огромное количество заболеваний [16], и изучение их структуры и, главное, механизма взаимодействия с лигандами, может открыть новые возможности для дизайна новых лекарственных веществ [17] — эффективных и безопасных.

Источник