Что относится к бгкп

ГК «Униконс»

Продвижение и реализация комплексных пищевых добавок, антисептиков и др. продукции.

«Антисептики Септоцил»

Септоцил. Бытовая химия, антисептики.

«Петритест»

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

«АльтерСтарт»

Закваски, стартовые культуры. Изготовление любых заквасок для любых целей.

ВНИМАНИЕ: Уважаемые клиенты и дистрибьюторы!

5.3. БАКТЕРИИ ГРУППЫ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК (БГКП) КАК ОСНОВНЫЕ САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

В группу БГКП входят представители нескольких родов семейства Enterobacteriaceae, в том числе Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. Эти микроорганизмы обладают многими общими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

Большинство бактерий группы кишечных палочек (БГКП) не разжижают желатина, свертывают молоко, расщепляют пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других Сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. По способности расщеплять лактозу при температуре 37°С БГКП делят на лактозоотрицательные и лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), или колиформные, которые нормируются по международным стандартам. Из группы ЛКП выделяются фекальные кишечные палочки (ФКП), способные ферментировать лактозу при температуре 44,5°С. К ним относится Е. coli, не растущая на цитратной среде.

В молоке БГКП хорошо размножаются, доводя его кислотность до 50- 80°Т и образуя в нем неровный ноздреватый сгусток. Молочнокислые микроорганизмы замедляют развитие БГКП. При режимах пастеризации, принятых в молочной промышленности, БГКП гибнут. Обычные дезинфицирующие средства полностью обеззараживают оборудование, инвентарь, руки от БГКП.

Дифференциацию БГКП можно проводить с помощью специальных тестов (комплекс признаков ТИМАЦ + Л):

И— индолообразование (способность эшерихий расщеплять аминокислоту триптофан с выделением индола);

А— реакция на ацетилметилкарбинол (ацетоин), выявляет способность микроорганизмов образовывать это вещество в среде с глюкозой; проводится качественная реакция с гидроксидом калия и креатином, дающая розовый цвет, такой способностью обладают только представители рода цитробактер;

При воздействии факторов внешней среды (например, в присутствии антибиотиков) свойства БГКП могут меняться. Для дифференциации видов дополнительно определяют уреазную активность, рост на средах с цианистым калием, ферментацию различных углеводов, используют специальные таблицы.

Источник

Определение бактерий группы кишечной палочки (бгкп) методом смывов

Определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП) методом смывов

В отделе ветеринарно-санитарной экспертизы и диагностики ГБУ “Оренбургская областная ветеринарная лаборатория” с 124.02.2017 по 03.03.2017 года проведены испытания 242 проб. В их числе продукты питания животного и растительного происхождения, биохимия мяса, а так же санитарно-зоогигиенические исследования: корма растительного и животного происхождения.

Определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП) методом смывов

Еще до возникновения медицины люди эмпирическим путем пришли к выводу, что в чистоте заключен залог здоровья. От той поры было очень далеко до представления о существовании БГКП, и смывы их брать было некому.

Регулярные умывания, стирка одежды, обработка продуктов питания перед использованием их в приготовлении блюд стали первыми зачатками санитарии. Постепенно количество навыков чистоплотности увеличивалось: чистка зубов, посещение бань или саун, канализование отходов.

Виды микробных загрязнений.

Изобретение микроскопа положило начало микробиологии, которая не только выявила наличие микроорганизмов, но и установила их связь с возникновением заболеваний у людей. Появились первые научно обоснованные санитарные правила, рекомендации и законы, охраняющие здоровье граждан.

Изучение инфекционных заболеваний людей и животных привело ученых к выводу о том, что источниками заражения являются они сами. Бактерии, являющиеся причиной болезней, попадают на продукты питания, предметы быта с микрочастицами кала или каплями слюны. Так были определены две большие группы бактериальных загрязнений.

Встал вопрос о том, присутствие какого вида бацилл точно свидетельствует об инфекционной опасности объекта или продукта питания. Ведь в кишечнике и ротовой полости сотни различных видов микробов. Была проведена колоссальная работа по выявлению показательных представителей микрофлоры. Определили две группы:

Во рту могут находиться разные виды стафилококков. Присутствие любого из стафилококков в большом количестве будет свидетельствовать о загрязнении. Но есть среди них особо показательный стафилококк. Это золотистый стафилококк, получивший свое название по цвету колоний, которые он создает на лабораторных средах.

БГКП в отличие от стафилококков составляют разнородные микроорганизмы: цитробактеры, эшерихии, шигеллы, иерсинии и другие бациллы. Их всех роднит между собой похожесть на главного представителя кишечной флоры. Это кишечная палочка. Хотя их свойства похожи, на лабораторных средах они образуют колонии разного вида и цвета.

Смывы на бгкп

Взятие смывов производится с помощью стерильных ув­лажненных ватных тампонов.

Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробирки с ватными пробками, заготав­ливают заранее в лаборатории.

В день взятия смывов в каж­дую пробирку с тампоном наливают (в условиях бокса над горелкой) по 5 мл стерильного 0,1% водного раствора пептона таким образом, чтобы ватный тампон не касался жид­кости.

Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажня­ют средой.

Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с по­верхности 100 см2, для ограничения поверхностей использу­ют шаблон (трафарет), сделанный из проволоки. Трафарет имеет площадь 25 см2, чтобы взять смывы с площади в 100 см2 его накладывают 4 раза в разных местах поверхнос­ти контролируемого объекта.

При взятии смывов с мелких инструментов обтирается вся поверхность предмета, при заборе смывов с тарелок про­тирают всю внутреннюю поверхность. При взятии смывов с мелких предметов одним тампоном протирают три одноимен­ных объекта — три тарелки, три ложки и т. п. У столовых приборов протирают их рабочую часть.

При исследовании стаканов протирают внутреннюю по­верхность и верхний наружный край стакана на 2 см вниз.

При взятии смывов с рук протирают тампоном ладон­ные поверхности обеих рук, проводя не менее 5 раз по каж­дой ладони и пальцам, затем протирают межпальцевые про­странства.

При взятии смывов с санитарной одежды протирают 4 площадки по 25 см2 — нижнюю часть каждого рукава и 2 площадки с верхней и средней частей передних пол спе­цовки. С различных мест полотенца берут 4 площадки по 25 см2.

Методика исследования смывов. Объем исследования

На предприятиях общественного питания исследование смывов проводят на присутствие бактерий группы кишеч­ных палочек.

Исследование на наличие золотистого стафилококка и протея, определение общей бактериальной обсемененности производится по показаниям.

а) исследование смывов на стафилококки проводят при обследовании кремово-кондитерских цехов, столовых и ресторанов, молочных кухонь и других пищеблоков,

обращая особое внимание на контроль рук персонала;

б) общую микробную обсемененность можно определить для установления эффективной обработки посуды, а также при оценке моющих и дезинфицирующих

Методика посева смывов на бактерии группы кишечных

Палочек

При плановых санитарно-гигиенических обследованиях для выявления БГКП производят посевы смывов на среды Кесслера с лактозой или Кода, при этом в пробирку со сре­дой опускают тампон и переносят оставшуюся смывную жидкость.

Посевы на средах Кесслера или Кода инкубируют при 37°С, через 18—24 часа со среды Кесслера производят высев на плотную дифференциальную среду Эндо, со среды Кода высев производят в случае изменения окраски среды или ее помутнения.

Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С на 24 часа, после чего просматривают. Из колоний, подозри­тельных или типичных для БГКП, готовят мазки, окраши­вают по Граму и микроскопируют. Обнаружение грамотри-цательных палочек указывает на наличие БГКП.

Дата публикования: 2015-11-01; Прочитано: 4985 | Нарушение авторского права страницы

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год.(0.001 с)…

Санитарно микробиологическое исследование молока и молочных продуктов

Для оценки санитарно-гигиенического состояния предприятий общественного питания, предприятий пищевой промышленности, лечебно-профилактических и детских учреждений проводят исследование смывов с рук персонала и предметов окружающей обстановки.

В зависимости от цели исследования определяют:

2. Наличие S. aureus.

3. Общее количество бактерий.

Исследования на патогенную микрофлору проводят только по эпидпоказаниям.

На предприятиях общественного питания и в детских учреждениях исследования обычно ограничивают выявлением БГКП (как показатель фекального загрязнения) и S. aureus.

В отделениях хирургического профиля (операционных, отделениях реанимации, интенсивной терапии и т. д.), кроме вышеуказанных показателей, определяют количественную обсемененность микроорганизмами, наличие синегнойной палочки и протея.

Отбор проб. Взятие проб осуществляют методом смывов. Используют ватные тампоны (палочка с намотанной на нее ватой вставлена в пробирку) или салфетки 5×5 см, которые захватывают стерильным пинцетом. Тампоны и салфетки увлажняют, помещая их в пробирки с 2 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Примечание. Марлевые салфетки, предварительно завернутые по одной в бумажные пакетики, и ватные тампоны, помещенные в пробирки, стерилизуют в стерилизационном шкафу 1 ч при 160° С.

Смывы с рук делают в следующей последовательности: начинают с левой руки, с участков меньшей загрязненности — протирают тыльную сторону руки от кисти к пальцам, затем ладонную сторону, между пальцами и под ногтевым ложем. Этим же тампоном в такой же последовательности производят смывы с правой руки.

Смывы с предметов обихода при контроле больших поверхностей делают из нескольких мест. Исследуемые участки ограничивают рамкой трафарета площадью 50×50 или 100×100 см2. Трафарет изготовляют из проволоки и перед употреблением прожигают над пламенем горелки.

Примечание. Смывы, как правило, берут с чистых, подготовленных к работе предметов, а с бывших в употреблении — только по эпидпоказаниям.

Исследование на БГКП

Первый день исследования

Взятые смывы засевают на среду Кода. При росте кишечной палочки среда изменяет цвет. При изменении цвета среды исследуемый материал пересевают на среду Эндо.

Второй день исследования

Изучают колонии на среде Эндо. Из подозрительных колоний делают мазки и микроскопируют. Дальше исследование ведут по обычной схеме.

Выявление S. aureus

Полученные смывы засевают на желточно-солевой агар в чашке Петри и параллельно на 6,5% солевой бульон (среда накопления). На желточно-солевой агар можно сделать посев тампоном. Бульон предварительно разливают в пробирки по 5 мл и в каждую засевают 0,2-0,3 мл смыва. Посевы инкубируют при 37° С в течение 24 ч. Дальше исследование ведут по общепринятой методике.

Определение общего числа бактерий

Первый день исследования

К 2 мл взятых смывов прибавляют 8 мл изотонического раствора натрия хлорида. Получается разведение 1:5. Тампоны тщательно отмывают встряхиванием.

1 мл засевают в чашку Петри и заливают 12 мл расплавленного и остуженного до 45° С агара. Чашки инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Второй день исследования

Посевы вынимают из термостата, подсчитывают количество выросших колоний и делают пересчет на 1 см2 исследуемой поверхности.

Выявление синегнойной палочки (см. главу 24).

Выявление протея (см. главу 32).

Внимание! Выявление в смывах патогенной флоры производят только по эпидпоказаниям.

Контрольные вопросы

1. С какой целью проводят исследование смывов с рук и предметов обихода?

2. Какие основные исследования проводят?

3. Как определяют общее количество бактерий?

4. На какую среду засевают смывы для:

б) выделения S. aureus?

Задания

1. Приготовьте тампоны.

2. Сделайте смывы с рук друг у друга и посейте на среду Эндо (смывы произвести до мытья рук и после мытья).

3. На второй день учтите результаты посевов.

Дата добавления: 2016-11-22; просмотров: 503 | Нарушение авторских прав

Бактерии группы кишечной палочки

5 мес. Основным источником возбудителя является больной человек. Механизм передачи возбудителя — фекально-оральный, через пищевые продукты, воду, загрязненные руки, игрушки и т.п.

Естественная восприимчивость людей к этому возбудителю очень высока, особенно среди новорожденных и ослабленных детей.

Основными эпидемиологическими признаками заболевания являются диарея, тошнота, рвота, кишечные спазмы, небольшая лихорадка.

Клебсиеллы известны как возбудители заболеваний дыхательных путей (пневмонии, риносклеромы), а также заболеваний урогенитального тракта, мозговых оболочек, глаз, суставов и позвоночника.

Кроме того, клебсиеллы описаны как возбудители различных заболеваний животных: мастита, пневмонии, септицемии. Они широко распространены в природе: почве, воде, цветах, зернах, семенах, овощах. Выделяются из морской и питьевой воды, молочных продуктов.

Патогенность клебсиелл была известна с момента их описания. Немецкий исследователь Е. Клебс обнаружил возбудителя в бронхиальном секрете лёгких, почках и жидкостях мозговых желудочков людей, умерших от крупозного воспаления лёгких, осложненного менингитом.

Добавить документ в свой блог или на сайт

Похожие:

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:

Определение бактерий группы кишечных палочек БГКП (колиформных бактерий)

Сущность метода.

Метод основан на способности БГКП сбраживать лактозу при высеве в среду Кесслер.

При исследовании сухих продуктов, подвергающиеся различным способам термической обработки перед употреблением (то есть разведение кипяченой водой (85±1)0С и выше, доведения до кипения и т.д.

), биологически активные добавки (БАД), стерилизованные кисло-молочные (сухие и жидкие), а также пастообразные продукты (в том числе продукты детского питания), а также составляющие их компоненты, определение БГКП проводят без предварительной инкубации.

Сухие продукты, предназначенные для детей с первого дня жизни, а также некоторые виды продуктов функционального питания, употребляемые после восстановления при (37±1)0С и (70±1)0С, перед посевом должны подвергаться предварительной инкубации в разбавленном фосфатном буферном растворе для восстановления физиологических свойств бактерий, поврежденных в процессе технологической обработки продукта.

Посев с предварительной инкубацией сухих молочных продуктов для детского и функционального питания.

Асептически взвешивают 1 г. сухого продукта и вносят в пробирку с

9,0 см3 разбавленного фосфатного буфера для предварительного обогащения. Взвесь тщательно перемешивают, проверяют значение рН при помощи индикаторной бумаги. При необходимости активную кислотность доводят до рН = 7 ед., используя стерильные растворы 1н гидроокиси натрия или 1 н соляной кислоты.

Колбы с исследуемым материалом термостатируют при температуре (37±1)0С в течение 24 часов. После чего проводят засев 1,0 см3 проинкубированной взвеси исследуемого продукта в пробирку с 10,0 см3 среды Кесслер лактозой.

Если в исследуемом продукте (прямых посевах или посевах с предварительной инкубацией) отсутствуют признаки роста – газообразование или помутнения среды, дают заключение об отсутствии БГКП (колиформных бактерий). При наличии признаков роста, из колб или пробирок, где наблюдается газообразование или помутнение среды Кесслер с лактозой, производят высев на чашки со средой Эндо или Левина.

Прямой посев.

Посев производят микробиологической петлей из каждой пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний. Для этого чашки Петри со средой визуально разбивают по секторам и проводят посевы отдельно на каждый сектор, или на отдельные чашки. Чашки с посевом термостатируют при температуре (37±1)0С от 18 до 24 часов.

При определении E. Coli пробирки с исследуемым продуктом в среде Кесслер с лактозой термостатируют при температуре (44±1)0С в течении (24±1) часов. А при наличии признаков роста подвергают аналогичному дальнейшему исследованию.

Учет результатов.

При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний типичных для БГКП (колиформных бактерий) засеянная навеска продукта считается незагрязненной ими, то есть исследуемый продукт соответствует нормативу.

При наличии на средах типичных для БГКП колонии, для делают препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют (см. метод микроскопирования).

Типичные колонии БГКП.

При обнаружении грамотрицательных не содержащих спор палочек указывает на наличие БГКП (колиформных бактерий) в анализируемой массе продукта и несоответствие продукту микробиологическому нормативу.

Если в результате микроскопирования, подтверждается наличие E. Coli в исследуемом продукте, то все типичные колонии подвергают идентификации по ИМАЦ- тестам (реакция на индол, реакция Фогес – Проскауэра, реакция с метиловым красным, утилизация цитратов).

Типичные колонии E. Coli

При обнаружении в 10 г. продукта бактерий родов Enterobacter и Citrobacter, но при отсутствии БГКП (колиформных бактерий) в 1 г. продукта, продукт браковке не подлежит.

Обнаружение на среде Эндо колоний с желтым или желто-коричневым оттенком при анализе сухих молочных каш, содержащих в качестве компонента рисовую или гречневую муку, овсяное молоко, манную крупу, указывает на принадлежность выделенных бактерий к роду Erwinia.

В этом случае (при отсутствии пигментных микроорганизмов для БГКП) исследуемый продукт считается соответствующий нормативу на БГКП (колиформные бактерии). Так как бактерии рода Erwinia являются представителями эпифитной микрофлоры зерновых культур и не обладают патогенностью для человека.

Для идентификации бактерий рода Erwinia, выросших на среде Эндо, их пересевают на питательный агар с 5% сахарозы, на котором они дают мукоидный рост не свойственный БГКП.

Метод микроскопирования.

Сущность метода.

Метод основан на просмотре окрашенных препаратов под микроскопом для ориентировочной характеристики морфологии.

Проведение анализа.

На чистое предметное стекло наносят микробиологической петлей небольшую каплю исследуемого материала и распределяют на площади приблизительно 1 см2. При исследовании пастообразных продуктов или агаровой культуры на стекло наносят каплю стерильной воды, а затем вносят в нее петлей продукт, тщательно перемешивают и растирают на площади 1 см2.

Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют на пламени горелки и красят метиленовым голубым или раствором карболового кристаллического фиолетового (окрашивают по Граму). Далее микроскопируют.

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП) и сальмонеллы: характеристика, санитарно-показательное значение, методы определения, нормирование в пищевых продуктах

БГКП. К бактериям группы кишечных палочек (колиформных) относят роды Escherichia (типичный представитель E. coli), Citrobacter (типичный представитель C. colicitrovorum), Enterobacter (типичный представитель E. aerogenes), которые объединены в одно семейство Enterobacteriaceae благодаря общности свойств.

Общая хар-ка БГКП: – палочки грамм-отрицательные, короткие; – не спорообразующие; – на среде Энда дают красные колонии с металлическим блеском – E.coli, красные – энтеробактерии, розовые – цитробактерии, б/цв – лактозо – отрицательные.Биохимические свойства.

Большинство бактерий группы кишечных палочек (БГКП) не разжижают желатина, свертывают молоко, расщепляют пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. Устойчивость.

Бактерии группы кишечных палочек обезвреживаются обычными методами пастеризации (65-75°С). При 60°С кишечная палочка погибает через 15 минут. 1% раствор фенола вызывает гибель микроба через 5-15 минут.Санитарно-показательное значение. Бактерии рода Escherichia– постоян.

обитатели кишечника чел и животн, и обнаружение их в воде и ПП свидетельств о свежем фекальном загрязнении. Бактерии родов Citrobacter и Enterobacter могут находиться повсюду: в почве, на растениях, реже в кишечнике.

Считают, что они предст собой результат изменен ишерихий после пребывания их во внешней среде и поэтому являются показателями более давнего фекального загрязнения. Значение БГКП:

– в сыром молоке указывает – на на эпидемиологическую опасность

– через несколько часов при 8-10оС – о нарушении условий хранения и реализации, транспортиров.

– появл. БГКП после пастеризации расценивают как 2-ое загрязнение

– наличие БГКП в готовой продукции указывает на – плохую мойку и дезинфекцию оборудования.

Род Salmonella. Сальмонеллезы относятся к числу наиболее распространенных токсикоинфекций. Обнаруж сальмонелл всегда свидетельствует о фекальном загрязнении. Сальмонеллы устойчивы к высоким концентрациям поваренной соли (особенно в средах, содержащих белок) и высушиванию.

Сохраняют свою жизнеспособность в комнатной пыли, в различных почвах (97 мес.), в воде открытых водоемов (до 45 дн). Находясь в ПП, особенно в мясных, сальмонеллы очень устойчивы к тепловой обработке. Соление и копчение мяса оказывают слабое воздействие на сальмонелл.

При размножении сальмонелл в молоке его внешний вид и вкус не изменяются, пастеризация молока в течение 30 мин при 85ºС в производственных условиях способствует полному уничтожению этих бактерий. Человек заражается сальмонеллами в результ употребл мяса и мясопродуктов.

Молоко и молочные продукты гораздо реже явл причиной пищевых отравлений. Инфицирование молока главным образом происходит через загрязненную посуду, доильные аппараты, руки доильщиц и др.

Возбудители сальмонеллезов могут попасть в ПП, изготовленные из растительного сырья (салаты и соусы столовые) не только в процессе производства, но и с пищевыми ингредиентами, в частности с сухими овощными приправами и специями.

Идентификация БГКП:

● Посев на среду обогащения – Кесслер, одновременная идентификация по газообразов.: есть газообразование – возможно БКГП, нет газообразования – нет БГКП

● Идентификация БГКП на среде Эндо: Из газ(+) пробирок отбирают по 1 мл и сеют на тв.среду Эндо, идентифицируют колонии БГКП по цвету, проводят дифференциацию по родам в зависимости от цвета колоний: Если есть красные, розовые и бледно-розовые культуры – значит присутствуют БГКП, если нет колоний – нет БГКП.

Если есть колонии, но бесцветные – подозрение на патогены. Далее по цвету идентифицируют роды БГКП: 1) красные – с металлич. оттенк.

– эшерихия 2) розовые – энтеробактер 3) бледно-розовые – со слизью – клебсиела 4) бледно-розовые – цитробактер, церрации 5) бесцветные (лактозо (-)) – протей 6) прозрачные мелкие – патогенны

● Идентификация на среде Козера: выращивание на среде с глюкозой/лимонной кислотой, Т=43°С,24ч. М/о цитрат(+) меняют цвет красителя с зеленого на васильковый. М/о цитрат(-) не меняют цвет.

Определяют по количеству положительных проб в 3 пробирках.

Сальмонеллы – патогенны, анализируют в 25 г продукта, их там не должно быть. Служат индикатором патогенов.

Выявление сальмонелл проводится в 4 этапа

1) первичный (прямой) посев – Посев на среду Энда и Плоскирава на сутки и Т=370С. На ср. Энда – прозрачные колонии,

2) обогащение (посев на жидкие селективные среды, термостатирование)

3) посев со среды обогащения осущ после обогащения на плотные диагностические среды, термостатирование – на ср. Плоскирава- прозрачные,но более мелкие чем на среде Эндо

4) подтверждение путем установления ферментативных и серологических свойств сальмонелл

Определение колиформных бактерий (БГКП)

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 8Следующая ⇒

Количество колиформных бактерий выражают в виде коли-титра или коли-индекса. Коли-титр воды – минимальное количество БГКП в 1 л воды. Коли-индекс воды – количество БГКП в 1 л воды.

Для определения этих показателей используют метод мембранных фильтров и титрационный (бродильный) метод.

Исследование воды методом мембранных фильтров. Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим признакам.

Перед использованием мембранные фильтры проверяют на отсутствие трещин, отверстий, пузырей и кипятят в дистиллированной воде в течение 10 мин (при этом нельзя допускать скручивания фильтров).

Для полного удаления из фильтров остатков растворителей, которые применяются при их изготовлении, кипячение следует повторить 3-5 раз со сменой дистиллированной воды. Подготовленные таким образом фильтры сохраняются в банках с дистиллированной водой или в сухом виде.

В день постановки опыта фильтры повторно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 10 мин.

Фильтрование производят с помощью специальных приборов или фильтра Зейтца. Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом.

После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

Отросток колбы, в которую фильтруется вода, с помощью резиновой трубки соединяют с водоструйным или масляным насосом для создания вакуума в приемном сосуде (около 0,25 атм).

Объем пробы воды зависит от целей исследования. При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, и в наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее 333 см3, профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.

На этапах очистки анализируют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных в зависимости от ее качества таким образом, чтобы на одном из фильтров вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек.

При этом необходимо ориентироваться на результаты предыдущих анализов воды в этих же пунктах (например, для воды после первичного хлорирования могут быть выбраны объемы 10 и 100 см3; для воды необеззараженной – 0,1, 1 и 10 см3).

При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3-4 десятикратных объема (например, из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; 100; 200 см3 воды; по этапам очистки – 0,1; 1; 10; 100 см3 воды).

Для фильтрования в воронку или стакан наливают необходимые объемы воды, начиная с меньших, а затем большие, каждый раз меняя фильтры. Самый меньший объем воды – 1 мл – следует фильтровать через фильтр, предварительно смоченный стерильной водой.

После фильтрования верхнюю часть прибора снимают и фильтр осторожно (при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на фильтре) стерильным пинцетом переносят на среду Эндо в чашку Петри. Фильтр накладывают вверх поверхностью, на которой осели бактерии, избегая появления пузырьков воздуха между фильтром и средой.

На одну чашку можно разместить 4 фильтра, под каждым на дне чашки следует надписать объем воды, номер пробы и число.

Если вода мутная, то фильтрование ведется сразу через два фильтра: предварительный фильтр № 6 (для задержания крупных частиц) помещают на фильтр № 2. После фильтрования оба фильтра переносят на среду Эндо. Чашки с фильтрами помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. При окончательном результате учитывают колонии, выросшие на обоих фильтрах.

При наличии в воде БГКП на фильтрах появляется рост типичных для этих бактерий колоний: темно-красные с металлическим блеском или красные, розовые с красным центром, имеющие четкий отпечаток на обратной стороне фильтра. Бактерии из таких колоний окрашивают по Граму и микроскопируют.

С культурой грамотрицательных бактерий лактозополо-жительных колоний ставят оксидазный тест для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от Pseudomonadaceae (последние являются оксидазообразующими бактериями).

Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-п-фенилендиамином. При наличии оксидазы реактив окрашивает колонию в синий цвет.

2-3 колонии, не изменившие окраску (оксидазоотрицательные) засевают в пробирку с полужидкой средой с 0,5% раствором глюкозы и инкубируют при 37°С. При появлении кислоты и газа результат считают положительным. Подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Колииндекс (индекс ОКБ, БГКП) высчитывают следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножают на 1000 см3 и делят на этот объем воды.

где К- количество проверенных на принадлежность к ОКБ (БГКП) колоний на фильтрах;

V- объем профильтрованной воды через фильтры, на которых велся учет.

Пример 1. При посеве трех объемов воды по 100 см3 на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; коли-индекс равен (3*1000):300 = 10.

Пример 2. При посеве 10 и 100 см3 воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; коли-индекс равен (6*1000):110 = 54.

Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтровании которого на фильтре выросли изолированные колонии.

Для перевода индекса в титр используют формулу:

В соответствии с ГОСТ, у воды питьевой индекс ОКБ должен быть не более 3, у воды плавательного бассейна – не более 10.

Метод мембранных фильтров является современным, точным, менее трудоемким и более дешевым в сравнении с титрационным методом.

Он удобен и тем, что позволяет концентрировать бактерии, содержащиеся в значительном объеме воды на небольшой поверхности фильтра.

Однако одним из самых существенных недостатков метода является то, что этим методом выявляется меньшее количество бактерий в сравнении с титрационным. Для большей точности рекомендуется исследование воды проводить параллельно обоими методами.

Титрационный метод исследования воды основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциально-диагностическую среду и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

Объем засеваемой воды зависит от характера исследуемого объекта, но обязательно посев ведется в 2-3, а в некоторых случаях – в 5-ти повторностях.

Объемы воды выбирают с таким расчетом, чтобы в одном из разбавлений получить хотя бы один отрицательный результат.

При исследовании на этапах очистки и обеззараживания засевают 100; 10; 1 и 0,1 см3 воды; на выходе в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках засевают три объема по 100 см3, три объема по 10 см3 и три объема по 1 см3.

Посев воды производится в глюкозопептонную среду (1% пептонная вода, 0,5% раствор глюкозы, 0,5% раствор хлорида натрия, индикатор Андреде, поплавок). Для посевов больших объемов воды используют концентрированную среду, содержащую 10-кратные количества указанных веществ.

Так, посев 100 мл воды производят в 10 мл концентрированной среды, 50 мл – в 15 мл концентрированной среды, 10 мл – в 1 мл концентрированной среды; 1 мл и последующие разведения – в 10 мл глюкозопептонной среды нормальной концентрации. Большие объемы воды засеваются во флаконы или колбы, меньшие – в пробирки.

Посевы инкубируют в термостате в течение суток при температуре 37°С.

Из пробирок с посевами, в которых наблюдается помутнение (а также образование кислоты и газа в поплавке), делают высев петлей штрихами на поверхность среды Эндо, разделенной на 3-4 сектора. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 16-18 ч.

При наличии на среде Эндо характерных для БГКП колоний (красных с металлическим блеском) следует провести все тесты, перечисленные выше.

Положительный ответ на наличие БГКП дается в том случае, если наблюдается рост характерных колоний, образованных оксидазоотрицательными, Гр(-) бактериями, сбраживающих глюкозу при 37°С с образованием кислоты и газа. Таким образом, положительный ответ выдается через 40—42 ч.

Результат выражается в виде индекса (титра) БГКП, цифровое выражение которого определяют по таблицам: при анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее – по табл. 5 и 6; при анализе воды на этапах очистки и обеззараживания – по табл. 7.

Таблица 5. Определение индекса БГКП при исследовании 300 см3 воды.

Таблица 6. Определение коли-индекса БГКП при исследовании 500 см3 воды.

Таблица 7. Определение индекса БГКП при исследовании воды по этапам очистки.

Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ)

ТКБ определяют теми же методами, как и БГКП, кроме последнего этапа идентификации, который проводится по ферментации лактозы на полужидкой питательной среде при 44,5°С. В случае роста на среде Эндо типичных лактозоположительных колоний, Гр(-), оксидазоотрицательных, способных ферментировать лактозу при 44,5°С, их учитывают как ТКБ, индекс или титр определяют по таблице 6.

Определение колифагов.

Присутствие колифагов (бактериофагов, паразитирующих на Е. coli) определяют методом агаровых слоев по Грациа.

Для определения используют чувствительные музейные культуры микроорганизмов (тест-организмы): мутант Salmonella tuphimurium, непатогенный для человека, штамм Escherichia coli К-12 Hfr из соответствующей коллекции культур АТСС 23631 или NTCT12486, штамм E.coli рода CN, называемый WG5, а также бактериофаги MS2, NCTC12487 или АТСС 15597 для контроля чувствительности тест-организмов.

За 18-24 часа перед проведением анализа необходимо сделать посев тест-культуры E.coli К12 F+ на скошенный питательный агар (МПА). Перед проведением анализа сделать смыв с «косяка» 5 мл стерильной водопроводной воды и по стандарту мутности приготовить взвесь тест-организма в концентрации 109 бакт. клеток/мл.

Расплавить и остудить до 45°С 2%-ный питательный агар. Исследуемую воду 100 мл внести в 5 стерильных чашек Петри (по 20 мл в каждую). В питательную среду добавить смыв E.coli (из расчета 1 мл на 100 мл агара) и хорошо перемешать.

Полученной смесью залить по 30 мл сначала пустую чашку Петри (контроль), а затем все чашки, содержащие исследуемую воду. Содержимое чашек перемешивают вращательными движениями.

После застывания питательной среды чашки переворачивают вверх дном и ставят для инкубирования в термостат при 37°С на 18-24 ч.

В результате индикаторная культура образует равномерный сплошной рост, а при наличии колифагов в этом «газоне» образуются прозрачные бляшки («негативные колонии» бактериофага). Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5-ти чашкках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл воды. В контрольной пробе бляшки должны отсутствовать.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий.

Испытуемую воду вносят в расплавленную и остуженную среду Вильсона—Блера. Среда содержит тиосульфат (гипосульфит) и бесцветную соль железа. В результате прорастания спор, размножения клостридий и восстановления ими сульфита образуется сульфид железа, который придает среде черный цвет.

Количественно эти микроорганизмы в воде можно определить методом мембранной фильтрации или прямым посевом.

Перед посевом пробу воды прогревают на водяной бане при температуре 75±5°С в течение 15 мин для уничтожения вегетативных форм. При исследовании хлорированной воды, ее можно не прогревать.

Применяя метод мембранной фильтрации, пробу воды определенного объема пропускают через фильтр, который затем помещается в пробирку с подготовленной расплавленной питательной средой верхней стороной внутрь (пробирка с питательной средой после посева должна быть немедленно охлаждена в холодной воде во избежание попадания воздуха) или в чашку Петри на поверхность питательной среды, которая затем заливается той же питательной средой толстым слоем.

Метод прямого посева предполагает посев в стерильные пробирки 20 мл воды следующим образом: по 10 мл в 2 пробирки (объемом не менее 30 мл), или по 5 мл в 4 пробирки (объемом не менее 15 мл).

Сверху посевы воды заливают горячим (75-80°С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Пробирки с посевами быстро охлаждают в стакане с холодной водой, инкубируют при 44°С в течение 24 ч.

Количественному учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтре, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфит-редуцирующих клостридий в определенном объеме воды (подвергнутой анализу).

Законодательная база Российской Федерации

7. Определение общих колиформных бактерий (БГКП)

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП) давно уже считаются удобными микробными индикаторами. Показатель “бактерии группы кишечных палочек” (БГКП) приведен в соответствие с принятой международной номенклатурой, который идентичен показателю “общие колиформные бактерии”. К колиформам относятся грамотрицательные бактерии, имеющие форму палочек, способных развиваться в присутствии солей желчных кислот или других поверхностно-активных агентов с аналогичной способностью к подавлению роста и способных ферментировать лактозу при t (35 – 37 °C) с образованием кислоты, газа и альдегида, то есть на среде Эндо лактозоположительные колонии дают отпечаток в течение 24 – 48 ч. Они оксидазоотрицательные и не образуют спор.

Бактерии группы кишечной палочки включают следующие роды: эшерихия, клебсиелла, энтеробактер, цитробактер и серрации.

При анализе почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется проводить определение титрационным методом. В качестве ускоренного метода для анализа слабозагрязненных почв рекомендуется использовать метод мембранной фильтрации. При анализах проб с предполагаемой высокой степенью фекального загрязнения можно проводить прямой поверхностный посев разведения суспензии на поверхность среды Эндо.

Для исследования используют предварительно подготовленные почвенные суспензии и разведения по описанной выше методике.

Титрационный метод определения индекса БГКП (колиформ) в почве

Из первого разведения почвенной суспензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10,0 куб. см, засевают во флаконы с 90,0 куб. см жидкой лактозо-пептонной среды (ЛПС) или среды Кесслера, что соответствует засеву 1 г почвы. Соотношение между навеской почвы или ее эквивалентным разведением и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации – 1:1.

Посев меньших количеств (0,01 г, 0,001 г, то есть 10(2), 10(3) и т.д.) делают по 1,0 куб. см из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9,0 куб. см тех же сред. Титрование проводят до разведения 1:1000000, то есть 10(6) с регулярной сменой пипеток при переходе от одного разведения к другому. Посевы инкубируют в течение 48 ч при (37 +/- 1) °C, через (24 +/- 2) ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. Отсутствие газообразования и помутнения через 48 ч инкубации выдают окончательный отрицательный ответ.

При наличии в посевах признаков роста: помутнения и газообразования или только помутнения – производится высев на поверхность среды Эндо.

Чашки с посевами помещают в термостат на (18 – 24) ч при температуре (37 +/- 1) °C. При отсутствии роста на чашках выдают отрицательный ответ. При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний, малиновых с металлическим блеском или без него проводят микроскопию колоний с последующей постановкой оксидазного теста. Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от бактерий рода Pseudomonoas и других видов сапрофитных бактерий. Микроскопирование и постановка оксидазного теста проводится по МУК 4.2.1018-01.

При наличии оксидазоотрицательных грам (-)палочек по 2 – 3 колонии каждого типа засевают параллельно в 2 пробирки в полужидкую или жидкую с поплавком среду с лактозой, разлитую в пробирки в количестве 4,0 – 5,0 куб. см, для подтверждения ферментации лактозы при температуре (37 +/- 1) °C. Учет производят через 18 ч инкубации. Если за это время происходит образование кислоты и газа, это свидетельствует о наличии бактерий группы кишечных палочек. Признаком газообразования является появление пузырьков газа, об образовании кислоты свидетельствует изменение цвета среды. При появлении только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного ответа еще на 24 ч, при отсутствии газообразования через этот срок выдают окончательный отрицательный ответ, при появлении газообразования – положительный ответ. После выявления БГКП устанавливают титр, при этом принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживаются колиформы. Для перевода титра в индекс необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр. Так, при титре 0,01 индекс равен 100, а при титре 0,1 индекс равен 10.

Определение БГКП в почве методом мембранной фильтрации

В качестве ускоренного метода для обнаружения колиформных бактерий целесообразно использовать метод мембранных фильтров.

Для микробиологических целей используются фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм и другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества. Метод основан на фильтрации установленного объема – 5,0 – 10,0 куб. см почвенной суспензии первого разведения (1:10) – через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной, питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам. Для того чтобы облегчить фильтрование почвенной суспензии через мембранный фильтр, желательно до фильтрования провести предварительную обработку.

Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя.

Подготовка фильтровального аппарата

Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой.

В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем, затем создают вакуум.

При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.

Следует начинать с фильтрования проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы. После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду Эндо с добавлением розоловой кислоты, разлитую в стерильные чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Эта среда используется только при работе методом мембранной фильтрации. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной пробы, номера и даты посева. На одну чашку можно поместить 3 – 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие БГКП в исследуемой почве.

Анализ заканчивают через 24 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к БГКП.

Для подтверждения наличия БГКП исследуют:

– все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;

– не менее 3 – 4 колоний каждого типа.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:

– наличие оксидазной активности;

– принадлежность к Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);

– ферментацию лактозы до кислоты и газа.

Для расчета индекса количества бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме почвы, умножают на 1000 и делят на этот объем.

Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета БГКП в почве

При анализе загрязненных и сильно загрязненных почв, отобранных в местах интенсивного фекального загрязнения, рекомендуется проводить прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,2 куб. см на поверхность среды Эндо и немедленно равномерно распределять по поверхности шпателем. Посев при анализах сравнительно чистых почв производится из разведении от 1:10 до 1:1000, то есть от 10(1) до 10(3). При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до 10(6). Посевы выращивают в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов, который проводится аналогично определению общих колиформных бактерий титрационным методом и подсчету количества колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашке, умножается на степень десятикратного разведения.

Источник