Что определяют методом ифа
Анализ на коронавирус методом ИФА
Анализ на иммуноглобулины класса G к спайковому (S) белку SARS CoV-2 позволяет определить уровень иммунной защиты к вирусу. Такое исследование целесообразно выполнять после вакцинации.
В связи с распространением коронавирусной инфекции COVID-19, отдельное внимание уделяется не только лечению, но и своевременному выявлению. Большинство медицинских учреждений начали тестирование с применения метода ПЦР (полимеразная цепная реакция). Он направлен на выявление вирусной РНК в эпителии верхних дыхательных путей. То есть, если человек уже переболел коронавирусной инфекцией, то результат ПЦР окажется отрицательным.
Далее диагностика COVID-19 стала проводиться с применением иммуноферментного анализа (ИФА). В отличие от ПЦР, ИФА позволяет выявить специфические антитела в крови. Отсюда вытекает одно важное преимущество метода. С его помощью можно выявить не только активные формы болезни, но и определить, переболел человек коронавирусом или нет.
Что такое иммуноглобулины и как они связаны с COVID-19
Иммуноглобулины (Ig) — это специфические белки, которые выделяются клетками иммунной системы в ответ на присутствие патогенов. Основными функциями иммуноглобулинов являются:
Выделяют несколько классов иммуноглобулинов, но если говорить о коронавирусной инфекции (и других заболеваниях), то наиболее интересными являются два из них — IgG и IgM.
Иммуноглобулины класса М первыми вырабатываются в ответ на проникновение в организм того или иного возбудителя. Поэтому определение данных антител играет важное значение в диагностике острой стадии заболевания, когда патоген присутствует в организме.
Иммуноглобулины класса G обеспечивают дальнейшую защиту от повторного проникновения возбудителя. Их максимальная концентрация отмечается примерно через три недели после заражения COVID-19.
Таким образом, IgM говорят о наличии острой инфекции, а IgG помогают подтвердить тот факт, что человек уже переболел.
Каждый желающий может протестироваться на COVID-19 в «ПрофМедЛаб». Вы можете вызвать нашего специалиста для проведения анализа на дом, а также заключить с клиникой договор на проведение тестирования у сотрудников от имени юридического лица.
В «ПрофМедЛаб» выполнено уже более 30000 анализов на коронавирусную инфекцию.
Особенности иммуноферментного анализа
Метод ИФА отличается простотой, высокой скоростью анализа (особенно актуально для экспресс-тестов) и позволяет получить дополнительную информацию (человек переболел или еще болеет). Кроме того, исследование может быть качественным и количественным. В первом случае определяет сам факт присутствия специфических иммуноглобулинов, а во втором определяется их концентрация, что позволяет косвенно судить о течении заболевания.
Вместе с тем у метода есть и определенные недостатки. Одним из них является относительно низкая чувствительность и специфичность. То есть ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Кроме того, иммуноферментный анализ будет неинформативным, если его проводить в первые несколько дней после заражения, так как уровень иммуноглобулинов повышается в течение 3–5 дней. Наконец, ИФА позволяет определить реакцию иммунной системы на присутствие в организме конкретного возбудителя, однако сам патоген выявить данным методом не получится.
Именно поэтому в некоторых случаях целесообразно сочетать ИФА и ПЦР для получения достоверных и максимально полных данных об особенностях течения коронавирусной инфекции.
Стоимость исследования
Клиника «ПрофМедЛаб» предлагает несколько видов тестов на антитела к COVID-19:
Срок готовности исследования — от 1 дня с момента забора материала. Цены на эти и другие виды анализов представлены в таблице:
Как заказать анализ?
Для сдачи анализа, пожалуйста, заполните форму ниже.
Для получения информации звоните по телефону: +7 (495) 120-08-07.
Научная электронная библиотека
Морозова В. С., Габрильянц О. А., Мягкова М. А.,
3.2.3. Иммуноферментный метод (ИФА)
Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.
Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:
1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.
2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.
3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.
Из-за разнообразия объектов исследования – от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.
Одним из принципов классификации методов ИФА является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакций. В соответствии с эти все методы можно разделить на две группы –
гомогенные и гетерогенные. Если в ходе выполнения анализа все реакции, включая ферментативную стадию, протекают в растворе, то метод является гомогенным. Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения [16].
В настоящее время EMIT (гомогенный ИФА) широко распространен во всем мире наряду с твердофазным ИФА (тИФА). EMIT по сравнению с тИФА является более экспрессным (до 2-х минут) и менее трудоемким, хотя менее чувствительный, и поэтому используется только в качественном анализе.
Возможна также классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным.
Рис. 10. Конкурентный (а) и неконкурентный (б) ИФА
Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод.
Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.
«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.
Другим типом классификации схем ИФА является разделение по типу определения концентрации анализуемого вещества:
1) прямое определение образовавшихся иммунокомплексов (аналитический сигнал прямо пропорционален концентрации определяемого вещества) – прямой ИФА;
2) определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступившими в реакцию компексообразования антител – непрямой ИФА.
Так, среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:
Прямой конкурентный формат ИФА использует в качестве меченного ферментом реагента одного из участников иммунохимической реакции (рис. 3) – определяемое соединение или специфический к нему диагностический реагент (антитела). В результате схема ИФА состоит из 3-х стадий:
– сорбции (иммобилизации) специфических антител, либо конъюгата антигена,
– аналитической стадии: конкурентной реакция Аг-Ат с участием меченого ферментом реагента (антигена или антител),
– фермент-субстратной реакции, в результате которой образуется окрашенный (или люминисцентный) продукт.
Например, на полистирольный планшет иммобилизуют специфические антитела (рис. 11 в) иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела. На второй стадии к иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. В этой схеме меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связывание с иммобилизованными специфическими антителами.
Рис. 11. Виды конкурентного ИФА:
а – непрямой конкурентный ИФА с иммобилизацией конъюгата антигена с высокомолекулярным веществом и использованием меченых антивидовых антител; б – непрямой конкурентный ИФА с иммобилизацией конъюгата антигена с высокомолекулярным веществом и использованием меченых специфических антител; в – прямой конкурентный ИФА с иммобилизацией специфических антител и использованием меченого антигена (аналита)
Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель
(рис. 11 а, б). Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА (рис. 11 а). На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина аналитического сигнала в этом случае находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.
Применение универсального реагента – меченых антивидовых антител – даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.
ИФА наркотических веществ и их метаболитов в биологических жидкостях и тканях широко используется в ХТЛ, бюро судмедэкспертизы, клинико-диагностических лабораториях, медицинских центрах. Чаще всего применяется полуколичественный вариант методики, т.к. в большинстве случаев необходимо дать заключение о том, превышает ли уровень метаболитов ПАВ в образце определенную пороговую концентрацию. Однако метод ИФА может использоваться (и используется в некоторых случаях) для количественного определения метаболитов ПАВ с высокой чувствительностью – до 10–9 г/л.
Отдельно следует выделить иммунохимический метод выявления фактов употребления наркотиков в отдаленные промежутки времени (до 4 месяцев после последнего употребления ПАВ), основанный на определении антител к наркотическим веществам в крови человека [4, 5]. Данный метод использует прямую неконкурентную схему ИФА.
Компоненты, используемые в ИФА
Ферментные метки обладают чрезвычайно мощным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тирозина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.
В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.
Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.
Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемилюминесцентных.
3. Антигены и антитела.
Аг и Aт, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. Кроме того, Аг должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные Аг вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.
Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или моноклинальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности Ат распад комплекса Аг-Ат приводит к удалению связанного Аг из системы. Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации Аг (Aт) в испытуемых образцах.
4. Получение конъюгата.
Конъюгат – это антиген или антитело, «сшитые» с ферментной меткой или белком-носителем. Получение коньюгата – один из важных этапов разработки ИФА.
При синтезе конъюгата с ферментом подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент – способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело – антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы ИФА. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.
Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с Аг или Aт и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и Аг или Aт осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.
В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.
Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:
– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;
– ковалентное прикрепление к твердой фазе;
– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).
Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорбция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсорбируемого вещества. В стандартных наборах ИФА используются 96-тилуночные прозрачные полистирольные планшеты.
Рис. 12. Набор для ИФА-определения наркотических еществ в биологических жидкостях: – планшет с нанесенным антигеном; 2 – положительный и отрицательный контрольный образец; 3 – реагент для выявления образовавшихся иммунных комплексов; 4 – растворы буфера для приготовления анализируемых образцов; 5 – раствор буфера для проведения фермент-субстратного окрашивания; – раствор для остановки реакции окрашивания субстрата; – инструкция по применению
Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорбируемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвращения неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу основного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты – бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.
Готовый набор для ИФА-определения наркотических веществ в биологических жидкостях выглядит следующим образом (рис. 12).
Что такое ИФА и для чего он применяется?
ИФА — иммуно — ферментный анализ, отличающийся высокой информативностью и точностью результатов, при достаточной оперативности и безболезненности проведения.
Иммуно ферментная диагностика поступила в арсенал медицинских специалистов в 60 — х годах прошлого столетия. На тот момент это был очень сложный, но перспективный анализ. С высоты прошедших десятилетий можно уверенно сказать, что предполагаемый потенциал ИФА раскрылся в полной мере.
Какова область применения ИФА?
Область применения рассматриваемого метода диагностики в современной медицине достаточно широка, при этом основными направлениями являются:
Как работает рассматриваемый метод диагностики?
Метод ИФА использует два основных инструмента: иммунная реакция и ферментная реакция, на практике оба инструмента взаимодействуют, обеспечивая желаемый результат и высокую информативность. Иммунная реакция широко применяется для поиска причин возникновения болезни, болезнетворных бактерий и микробов. В вою очередь, ферментная реакция используется для того, чтобы перевести полученные результаты в форму, доступную для исследований и измерений.
Для диагностики каких заболеваний применяется рассматриваемый метод?
С помощью ИФА можно подтвердить или опровергнуть наличие у человека большого количества заболеваний, наиболее распространенными на сегодняшний день являются:
Как осуществляется подготовка к проведению такого анализа?
Для того, чтобы результаты рассматриваемого метода диагностики оказались достаточно достоверными, «разговорчивыми» и информативными, пациенту следует помнить о правилах забора крови для проведения анализа. Наиболее значимыми, обязательными к соблюдению, являются:
Каковы сроки выполнения такого анализа?
После забора крови результат будет доступен пациенту в течение двух суток, то есть выполняется такой анализ достаточно быстро, несмотря на определенную сложность исследования.
Подводя итог, хочется сказать следующее: иммуно — ферментный анализ — достаточно эффективное, высокоточное исследование, отличающееся высокой информативностью при высокой оперативности проведения.
Сдать кровь на ИФА вы можете в нашей клинике
Что такое ИФА?
Иммуноферментный анализ в клинике
В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция антигена с антителом, а присоединение к антителам ферментной метки позволяет учитывать результат реакции антиген-антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня.
Какие инфекции можно выявить методом ИФА
В основном ИФА применяется для диагностики сифилиса (в комплексе с другими реакциями), ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов. Имеет ограниченное значение для диагностики хламидийной инфекции, цитомегаловирусной инфекции и других герпетических инфекций. Метод ИФА используется также для определения антител при различных инфекционных заболеваниях, уровня гормонов, аутоантител и различных маркеров онкологических заболеваний.
Исследование наличия и уровня антител различных классов в некоторых случаях помогает определить стадию инфекционного процесса.
Преимущества ИФА относительно других методов обнаружения антигенов и антител: