Что необходимо для репликации днк

Что необходимо для репликации днк

Репликация митохондриальной и ядерной ДНК происходит в разные фазы клеточного цикла. Несмотря на то что общая последовательность стадий при репликации ядерной ДНК у высших существ (эукариот) и у бактерий (прокариот) одинакова, сам процесс имеет незначительные отличия. Так, у эукариот во время репликации ДНК (ядерная) остаётся в нуклеосомной конфигурации.

Фрагменты ДНК, богатые парами оснований Г—Ц (R-полосы эухроматина в уплотнённом хроматине), экспрессируют гены «домашнего хозяйства», которые функционируют во всех клетках организма. Данные фрагменты реплицируются на ранней стадии S-фазы. Участки гетерохроматина, богатые парами оснований А—Т (G-полосы), экспрессируют небольшое количество генов и реплицируются на поздней стадии S-фазы.

Гены с большим содержанием пар А—Т, кодирующие различные свойства и функционирующие лишь в определённых клетках, входят в состав факультативного гетерохроматина. Их репликация происходит на ранней стадии S-фазы только в тех клетках, в которых они экспрессируются, и на поздних стадиях — в клетках, где экспрессии не происходит.

Область спирали ДНК, которая в начале репликации раскручивается в первую очередь, называют участком начала репликации (репликоном). В этом месте двойную нить расплетает фермент хеликаза, раскрывающий последовательность оснований. Процесс репликации происходит вдоль одной цепи со скоростью примерно 40-50 нуклеотидов в секунду одновременно в обоих направлениях. У высших существ имеется множество репликонов, расположенных на расстоянии 50 000—300 000 п.н. В месте разделения нити ДНК возникают репликационные вздутия, на каждом конце которого формируется репликационная вилка.

Новая ДНК синтезируется при участии ферментов, называемых ДНК-полимеразами, из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (АТФ, ГТФ и др.), которые превращаются в монофосфатные нуклеотиды (АМФ, ГМФ и др.). Отщепление и гидролиз пирофосфатов из трифосфатов обеспечивают процесс энергией и обусловливают его полную необратимость, делая молекулу ДНК достаточно устойчивой.

Все ДНК-полимеразы могут выстраивать новую ДНК только в направлении от 5′- к 3′-концу. Это означает, что ферменты должны двигаться вдоль матричной цепи от 3′- к 5′-концу. В связи с этим репликация может непрерывно происходить от репликона только по одной цепи, называемой опережающей. Из-за расположения Сахаров репликация по второй, отстающей цепи происходит только на коротких отрезках, известных как фрагменты Оказаки.

Длина новых фрагментов ДНК, образующихся вдоль отстающей цепи, в среднем составляет 100—200 пар нуклеотидов. Во время синтеза фрагменты Оказаки сшивает между собой фермент ДНК-лигаза. В ожидании репликации стабильность первичной одноцепочечной нуклеотидной последовательности отстающей цепи поддерживается белком, связывающим одноцепочечную ДНК (или спиральдестабилизирующим белком).

Для синтеза опережающей цепи необходим фермент ДНК-полимераза S, а для синтеза отстающей — ДНК-полимераза а. Последняя имеет субъединицу, называемую ДНКпраймазой, которая синтезирует короткую РНК-затравку, играющую роль праймера. Репликация мито-хондриальной ДНК происходит независимо от процессов в ядре. При этом используется ряд других ферментов, один из которых — ДНК-полимераза у.

В геноме присутствует большое количество копий пяти гистонных генов, благодаря чему происходит синтез множества гистонов (особенно во время S-фазы), которые сразу после репликации связываются с новой цепью ДНК.
Следует отметить, что процесс репликации носит название полуконсервативного, так как в состав дочерних молекул ДНК входит одна первичная цепь и одна синтезированная.

Репликация теломер ДНК

Основной проблемой синтеза ДНК на конце отстающей цепи служит то, что ДНК-полимеразе а необходимо прикрепиться выше конца последовательности, которая реплицирована, и работать проксимально в направлении от 5′- к 3′-концу. Для решения этой проблемы нужен ДНК-синтетический фермент теломераза, который продлевает отстающую цепь.

Теломераза — рибонуклеопротеин, содержащий матричную РНК с последовательностью 3′-ААУЦЦЦААУ-5′, которая комплементарна полутора повторам шестиосновной теломерной ДНК (5′-ГГГТТА-3′). Фрагмент последовательности 3′-ААУ РНК-теломеразы связывается с терминальным концом ТТА-5′ матричной отстающей цепи, при этом остальная часть РНК остаётся свободной. Затем к этой матричной РНК присоединяются дезоксирибонуклеотиды, тем самым продлевая повторяющуюся последовательность в ДНК на один сегмент.

После этого теломераза отщепляется и направляется к другому терминальному концу с последовательностью ТТА-5′, и процесс повторяется. Как только возникает достаточно длинный терминальный повтор, ДНК-полимераза а прикрепляется к полученному одноцепочечному фрагменту и достраивает вторую цепь по методу комплементарности в проксимальном 5’—3′-направлении, двигаясь к уже существующему двухцепочечному участку, последующее слияние с которым происходит благодаря действию ДНК-лигазы.

Репаративные механизмы ДНК

Иногда в растущую цепь случайно вклинивается неправильное основание, однако, к счастью, у здоровых клеток присутствуют пострепликационные репаративные ферменты и система коррекции ошибочного спаривания оснований, которые исправляют подобные ошибки. В основе механизма действия данных систем лежат удаление и замена ошибочно вставленных оснований в соответствии с последовательностью матричной цепи. Для их функционирования необходимы ДНК-полимеразы b и е.

Значение ДНК для медицины. Патология пострепликационных механизмов репарации иногда обусловливает предрасположенность пациентов к некоторым онкологическим заболеваниям. К ним относят синдром множественной ломкости хромосом (синдром Блума), наследственную предрасположенность к раку молочной железы, вызванную мутациями генов BRCA1 и BRCA2, и аутосомно-доминантную форму рака кишечника (наследственный неполипозный рак толстой кишки).

Существует теория, утверждающая, что после каждого клеточного цикла теломеры укорачиваются на один повтор, а следовательно, количество делений клетки ограничено числом повторов в теломерной цепи. Согласно этому бесконечный рост и деление опухолевых клеток происходят из-за присутствия активных мутантных теломераз, которые препятствуют разрушению теломер.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

— Вернуться в содержание раздела «генетика» на нашем сайте

Источник

Транскрипция и трансляция

Удвоение ДНК происходит в синтетическом периоде интерфазы. При этом общее число хромосом не меняется, однако каждая из них содержит к началу деления две молекулы ДНК: это необходимо для равномерного распределения генетического материала между дочерними клетками.

Транскрпиция (лат. transcriptio — переписывание)

Образуется несколько начальных кодонов иРНК.

Нити ДНК последовательно расплетаются, освобождая место для передвигающейся РНК-полимеразы. Молекула иРНК быстро растет.

Трансляция (от лат. translatio — перенос, перемещение)

Рибосома делает шаг, и иРНК продвигается на один кодон: такое в фазу элонгации происходит десятки тысяч раз. Молекулы тРНК приносят новые аминокислоты, соответствующие кодонам иРНК. Аминокислоты соединяются друг с другом: между ними образуются пептидные связи, молекула белка растет.

Примеры решения задачи №1

Без практики теория мертва, так что скорее решим задачи! В первых двух задачах будем пользоваться таблицей генетического кода (по иРНК), приведенной вверху.

«Фрагмент цепи ДНК имеет следующую последовательность нуклеотидов: ЦГА-ТГГ-ТЦЦ-ГАЦ. Определите последовательность нуклеотидов во второй цепочке ДНК, последовательность нуклеотидов на иРНК, антикодоны соответствующих тРНК и аминокислотную последовательность соответствующего фрагмента молекулы белка, используя таблицу генетического кода»

По принципу комплементарности мы нашли вторую цепочку ДНК: ГЦТ-АЦЦ-АГГ-ЦТГ. Мы использовали следующие правила при нахождении второй нити ДНК: А-Т, Т-А, Г-Ц, Ц-Г.

Вернемся к первой цепочке, и именно от нее пойдем к иРНК: ГЦУ-АЦЦ-АГГ-ЦУГ. Мы использовали следующие правила при переводе ДНК в иРНК: А-У, Т-А, Г-Ц, Ц-Г.

Зная последовательность нуклеотидов иРНК, легко найдем тРНК: ЦГА, УГГ, УЦЦ, ГАЦ. Мы использовали следующие правила перевода иРНК в тРНК: А-У, У-А, Г-Ц, Ц-Г. Обратите внимание, что антикодоны тРНК мы разделяем запятыми, в отличие кодонов иРНК. Это связано с тем, что тРНК представляют собой отдельные молекулы (в виде клеверного листа), а не линейную структуру (как ДНК, иРНК).

Пример решения задачи №2

«Известно, что все виды РНК синтезируются на ДНК-матрице. Фрагмент цепи ДНК, на которой синтезируется участок центральной петли тРНК, имеет следующую последовательность нуклеотидов: ТАГ-ЦАА-АЦГ-ГЦТ-АЦЦ. Установите нуклеотидную последовательность участка тРНК, который синтезируется на данном фрагменте, и аминокислоту, которую будет переносить эта тРНК в процессе биосинтеза белка, если третий триплет соответствует антикодону тРНК»

Пример решения задачи №3

Длина фрагмента молекулы ДНК составляет 150 нуклеотидов. Найдите число триплетов ДНК, кодонов иРНК, антикодонов тРНК и аминокислот, соответствующих данному фрагменту. Известно, что аденин составляет 20% в данном фрагменте (двухцепочечной молекуле ДНК), найдите содержание в процентах остальных нуклеотидов.

Теперь мы украсили теорию практикой. Что может быть лучше при изучении новой темы? 🙂

© Беллевич Юрий Сергеевич 2018-2021

Данная статья написана Беллевичем Юрием Сергеевичем и является его интеллектуальной собственностью. Копирование, распространение (в том числе путем копирования на другие сайты и ресурсы в Интернете) или любое иное использование информации и объектов без предварительного согласия правообладателя преследуется по закону. Для получения материалов статьи и разрешения их использования, обратитесь, пожалуйста, к Беллевичу Юрию.

Источник

Репликация

1. Когда происходит репликация? – В синтетической фазе интерфазы, задолго до деления клетки. Период между репликацией и профазой митоза называется постсинтетическая фаза интерфазы, в нем клетка продолжает расти и проверяет, правильно ли произошло удвоение.

2. Если до удвоения было 46 хромосом, то сколько будет после удвоения? – Количество хромосом при удвоении ДНК не изменяется. До удвоения у человека 46 одинарных хромосом (состоящих из одной двойной цепочки ДНК), а после удвоения – 46 двойных хромосом (состоящих из двух одинаковых двойных цепочек ДНК, соединенных между собой в центромере).

3. Зачем нужна репликация? – Чтобы во время митоза каждая дочерняя клетка могла получить свою копию ДНК. При митозе каждая из 46 двойных хромосом делится на две одинарные; получается два набора по 46 одинарных хромосом; эти два набора расходятся в две дочерние клетки.

Три принципа строения ДНК

Полуконсервативность – каждая дочерняя ДНК содержит одну цепочку из материнской ДНК и одну новосинтезированную.

Комплементарность – АТ/ЦГ. Напротив аденина одной цепи ДНК всегда стоит тимин другой цепи ДНК, напротив цитозина всегда стоит гуанин.

Антипараллельность – цепочки ДНК лежат друг к другу противоположными концами. Эти концы не изучают в школе, поэтому чуть подробнее (и далее – в дебри).

Мономером ДНК является нуклеотид, центральной частью нуклеотида – дезоксирибоза. У неё 5 атомов углерода (на ближайшем рисунке у левой нижней дезоксирибозы атомы пронумерованы). Смотрим: к первому атому углерода присоединяется азотистое основание, к пятому – фосфорная кислота данного нуклеотида, третий атом готов присоединить фосфорную кислоту следующего нуклеотида. Таким образом, у любой цепочки ДНК есть два конца:

Правило антипараллельности состоит в том, что на одном конце двойной цепи ДНК (например, на верхнем конце ближайшего рисунка) одна цепь имеет 5′-конец, а другая 3′-конец. Для процесса репликации важно, что ДНК-полимераза может удлинять только 3′-конец. Цепочка ДНК может расти только своим 3′-концом.

На этом рисунке процесс удвоения ДНК идет снизу вверх. Видно, что левая цепочка растет в том же направлении, а правая – в противоположном.

На следующем рисунке вверхняя новая цепочка («ведущая цепь») удлиняется в том же направлении, в котором происходит удвоение. Нижняя новая цепочка («отстающая цепь») не может удлиняться в том же направлении, потому что там у нее 5′-конец, который, как мы помним, не растёт. Поэтому нижняя цепочка растет с помощью коротких (100-200 нуклеотидов) фрагментов Оказаки, каждый из которых растет в 3′-направлении. Каждый фрагмент Оказаки растет от 3′-конца праймера («РНК-затравки», на рисунке праймеры красные).

Ферменты репликации

Overall direction of replication – направление, в котором происходит удвоение ДНК.
Parental DNA – старая (материнская) ДНК.
Зеленое облако рядом с надписью «Parental DNA» – фермент хеликаза, который разрывает водородные связи между азотистыми основаниями старой (материнской) цепочки ДНК.
Серые овальчики на только что оторванных друг от друга цепочках ДНК – дестабилизирующие белки, которые не дают цепочкам ДНК соединиться.
DNA pol III – ДНК-полимераза, которая присоединяет новые нуклеотиды к 3′-концу верхней (лидирующей, синтезирующейся неприрывно) цепочки ДНК (Leading strand).
Primase – фермент праймаза, которая делает праймер (красную деталь от Лего). Теперь считаем праймеры слева направо:

На суперкартине не обозначен фермент топоизомераза, но дальше а тестиках он будет фигурировать, так что скажем и про него пару слов. Вот вам веревка, состоящая из трех больших жил. Если три товарища возьмутся за эти три жилы и начнут тянуть их в три разные стороны, то очень скоро веревка перестанет расплетаться и завьется в тугие петли. С ДНК, которая представляет собой двухжильную веревку, могло бы произойти то же самое, если бы не топоизомераза.

Топоизомереза разрезает одну из двух нитей ДНК, после чего (второй рисунок, красная стрелка) ДНК проворачивается вокруг одной из своих цепей, так что тугие петли не образуются (топологический стресс снижается).

Концевая недорепликация

Из суперкартины с ферментами репликации понятно, что на месте, оставшемся после удаления праймера, ДНК-полимераза достраивает следующий по счету фрагмент Оказаки. (Правда понятно? Если что, фрагменты Оказаки на суперкартине обозначены цифрами в кружочках.) Когда репликация на суперкартине дойдет до своего логического (левого) конца, то у последнего (крайнего левого) фрагмента Оказаки не будет «следующего», поэтому некому будет достроить ДНК на пустом месте, получившемся после удаления праймера.

Вот вам еще рисунок. Черная цепочка ДНК – старая, материнская. Удвоение ДНК, в отличие от суперкартины, происходит слева направо. Поскольку у новой (зеленой) ДНК справа 5′-конец, то она является отстающей и удлиняется отдельными фрагметами (Оказаки). Каждый фрагмент Оказаки растет от 3′-конца своего праймера (синего прямоугольника). Праймеры, как мы помним, удаляются ДНК-полимеразой, которая на этом месте достраивает следующий фрагмент Оказаки (этот процесс обозначен красным многоточием). На конце хромосомы некому заделать этот участок, так как нету следующего фрагмента Оказаки, там уже пустое место (Gap). Таким образом, после каждой репликации у дочерних хромосом укорачиваются оба 5′-конца (концевая недорепликация).

Чтобы концевая недорепликация не приводила к печальным последствиям, на концах хромосом имеются участки, не несущие наследственной информации – теломеры. Их укорочение не приносит вреда; у человека они рассчитаны примерно на 60 репликаций. Больше 60 раз (число Хейфлика) клетки человека поделиться не могут, поскольку концевая недорепликация начинает затрагивать гены.

Стволовые клетки (в коже, красном костном мозге, семенниках) должны делиться гораздо больше, чем 60 раз. Поэтому в них функционирует фермент теломераза, который после каждой репликации удлиняет теломеры. Теломераза удлиняет выступающий 3′-конец ДНК, так что он увеличивается до размера фрагмента Оказаки. После этого праймаза синтезирует на нем праймер, и ДНК-полимераза удлиняет недореплицированный 5′-конец ДНК.

Тестики

2. Соотнесите функции ферментов, участвующих в репликации прокариот, с их названиями.

3. Во время репликации в эукариотических клетках удаление праймеров
А) осуществляется ферментом только с ДНК-азной активностью
Б) образует фрагменты Оказаки
В) происходит только в отстающих цепях
Г) происходит только в ядре

4. Если Вы проэкстрагируете ДНК бактериофага fX174, вы обнаружите, что в его составе находится 25% A, 33% T, 24% G, и 18% C. Как Вы могли бы обьяснить эти результаты?
А) Результаты эксперимента неправильные; где-то произошла ошибка.
Б) Можно было бы допустить, что процентное содержание A приблизительно равно таковому T, что также справедливо для C и G. Следовательно, правило Чаргаффа не нарушается, ДНК является двуцепочечной и реплицируется полуконсервативно.
В) Поскольку процентные соотношения A и T и, соответственно, C и G различные, ДНК представляет собой одну цепь; она реплицируется при помощи особенного фермента, следующего особенному механизму репликации с одной цепью в качестве матрицы.
Г) Поскольку ни A не равно T, и ни G не равно C, то ДНК должна быть одноцепочечной, она реплицируется путем синтеза комплементарной цепи и использованием этой двуцепочечной формы как матрицы.

5. Диаграмма относится к репликации двуцепочечной ДНК. Для каждого из квадратов I, II, III выберите один фермент, который функционирует на этом участке.

А) Теломераза
Б) ДНК-топоизомераза
В) ДНК-полимераза
Г) ДНК-геликаза
Д) ДНК-лигаза

6. Культура бактерий из среды с легким изотопом азота (N-14) перенесли в среду, содержащую тяжелый изотоп (N-15) на время, соответствующее одному делению, а затем вернули в среду с легким изотопом азота. Анализ состава ДНК бактерий после периода, соответствующего двум репликациям, показал:

7. Одно редкое генетическим заболевание характеризуется иммунодефицитом, отставанием в умственном и физическом развитии и микроцефалией. Предположим, что в экстракте ДНК пациента с этим синдромом вы обнаружили почти одинаковые количества длинных и очень коротких отрезков ДНК. Какой фермент у этого пациента наиболее вероятно отсутствует/дефектный?
А) ДНК-лигаза
Б) Топоизомераза
В) ДНК-полимераза
Г) Геликаза

8. Молекула ДНК, представляет собой двойную спираль, содержащую четыре различных типа азотистых оснований. Какое из следующих утверждений в отношении как репликации, так и химического строения ДНК, является правильным?
A) Последовательности оснований двух цепей одни и те же.
B) В двойной цепи ДНК содержание пуринов равно содержанию пиримидинов.
C) Обе цепи синтезируются в направлении 5’→3’ непрерывно.
D) Присоединение первого основания вновь синтезируемой нуклеиновой кислоты катализируется ДНК-полимеразой.
E) Активность ДНК-полимеразы по исправлению ошибок осуществляется в направлении 5’→3’.

9. Большинство ДНК-полимераз обладает также активностью:
А) лигазной;
Б) эндонуклеазной;
В) 5′-экзонуклеазной;
Г) 3′-экзонуклеазной.

Линейная одноцепочечная ДНК (ssDNA) длиной 6000 нуклеотидов была гибридизована с короткой (300 нуклеотидов) комплементарной одноцеаочечной ДНК, меченой радиоактивными нуклеотидами (a). Эта гибридизованная ДНК была обработана одним из трех способов: ДНК-хеликазой, кипячением без геликазы или прокипяченной геликазой. Затем образцы ДНК были подвергнуты электрофорезу в агарозном геле. На рисунке b показаны полосы ДНК, которые можно было обнаружить в геле при помощи авторадиографии. (Предположено, что необходимая для этой энзиматической реакции энергия АТФ была предоставлена во время обработки ДНК-хеликазой).

Какое из следующих утверждений относительно этого эксперимента является правильным?
А) Полоса, появляющаяся в верхней части геля, является только ssДНК, величиной 6,3 kb.
Б) Полоса, появляющаяся в нижней части геля, это меченная 300bp ДНК.
В) Если гибридизованную ДНК обработать только ДНК хеликазой и довести реакцию до конца, расположение полос выглядит так, как изображено на дорожке 3 на рисунке b.
Г) Если гибридизованную ДНК обработать только кипячением без обработки хеликазой, расположение полос выглядит как изображено на дорожке 2 на рисунке b.
Д) Если гибридизованную ДНК обработать только прокипяченной хеликазой, расположение полос выглядит как изображено на дорожке 1 на рисунке b.

Источник

Что необходимо для репликации днк

• Репликация происходит после прохождения клеткой точки рестрикции или START

• Репликация регулируется поэтапно и скоординирована с наступлением митоза

• Репликация происходит в точках инициации, которые могут обладать особой первичной структурой, специфическим положением, или располагаться в ДНК на определенных расстояниях

• Инициация происходит только в разрешенных точках, способных к репликации

• Осуществив свои функции, до наступления следующего цикла, точки начала репликации не могут использоваться повторно

Когда клетки проанализировали состояние окружающей среды и приняли решение вступить в цикл деления, они проходят точку G1/S и начинают репликацию ДНК. Как клетки объединяют и активируют факторы, необходимые для репликации ДНК? Какие механизмы контроля гарантируют, что клетка лишь однажды реплицировала ДНК, и только один раз в цикле?

Хотя пока невозможно дать полные ответы на эти вопросы, в результате идентификации и анализа последовательности дрожжевых хромосомных ДНК, способных к независимой репликации, было получено много информации о самом процессе репликации ДНК Эти последовательности в хромосоме, называемые автономно реплицирующиеся последовательности (ARS), являются частью точек начала репликации. Точка инициации или начала (ориджин репликации) представляет собой участок последовательности ДНК, на котором начинается репликация.

У почкующихся дрожжей, но не у большинства других организмов, точки начала репликации представлены небольшими консенсусными последовательностями. У сливающихся дрожжей эти точки занимают большие участки ДНК, богатые АД парами, но не отличаются какой-то особой структурой. У остальных эукариот точки начала репликации расположены случайно, в соответствии с распределением по геному белков, неспецифически связанных с ДНК.

Для того чтобы гарантировать своевременную дупликацию генома, на хромосоме должно быть достаточное количество точек начала репликации. У бактерий для репликации единственной кольцевой хромосомы необходима лишь одна точка начала, однако у эукариот, имеющих большой геном, распределенный по многим линейным хромосомам, должно быть много точек начала репликации. У почкующихся дрожжей, величина генома которых составляет около 13 Мб, в 16 хромосомах находится примерно 400 точек начала репликации.

Это создает несколько проблем, связанных с регуляцией процесса репликации. Функционирование точек начала репликации должно быть скоординировано с клеточным циклом таким образом, чтобы репликация начиналась только в течение S фазы. Должна быть полная уверенность в том, что репликация завершилась до перехода клетки в митоз. Каждая из точек начала репликации должна функционировать только один раз, с тем чтобы гарантировать, что ДНК реплицируется лишь один раз за цикл.

В продолжение всего клеточного цикла 0RC связан с точкой начала репликации на хромосоме.
В течение короткого промежутка времени, от поздего митоза до G1, с точкой начала также связываются белки, активирующие репликацию,
Cdc6 и Cdt1, что, в свою очередь, активирует гексамерный МСМ геликазный комплекс (МСМ2-7).
Этот этап завершает снятие блока репликации и сборку пре-RC.

Точки начала репликации связывают факторы, необходимые для активации репликации и инициации синтеза ДНК. Инициация репликации ДНК происходит только в тех точках, которые содержат связанные факторы и которые поэтому относятся к разрешенным точкам. Однако в каждом раунде репликации ДНК в процессе участвует ограниченный набор потенциальных начальных точек, присутствующих в хромосомах. Более того, по мере активации в разное время различных разрешенных начальных точек, события инициации также происходят через различные интервалы времени. Например, некоторые точки активируются в ранней S-фазе, а другие переходят в это состояние позже.

Неизвестно, чем задается этот временной фактор, но похоже, что расположение специфической точки начала репликации на хромосоме определяет время ее наступления.

Ддя того чтобы репликация началась, в точке начала должен сформироваться пререпликативный комплекс (pre-RC). В результате проведения генетических исследований на дрожжах и биохимических экспрериментов на экстрактах яйцеклеток Xenopus, выяснилась картина сборки pre-RC. Процесс начинается со связывания с ДНК комплекса из шести белков, который носит название комплекса, распознающего область начала репликации (origin recognition complex, ORC). Этот комплекс помечает потенциальную точку начала репликации, однако его недостаточно для активации. Он служит платформой для связывания еще двух консервативных белков: Cdc6, который относится к семейству ААА+АТФазы, и Cdt1. (Многие белки, обладающие АТФазным доменом, для выполнения работы используют энергию АТФ.)

Затем к ним присоединяется комплекс поддерживающий минихромосому (minichromosome maintenance complex, МСМ), представляющий собой кольцевую структуру, состоящую из шести родственных белков, которые также относятся к большому семейству ААА+АТФаз. Комплексы МСМ присутствуют в избытке и распространяются за пределы точки начала репликации. После присоединения МСМ, ORC и Cdc6 становятся необязательными компонентами и pre-RC переходит в состояние способное к активации. Порядок событий, происходящих при сборке pre-RC в точках начала репликации, схематически представлен на рисунке ниже.

Сборка pre-RC ограничена промежутком между концом М-фазы и ранней S-фазой, что объясняется следующими причинами. Во-первых, в клетке уровень белка Cdc6 контролируется таким образом, что он присутствует только в этот промежуток времени. В отсутствие белка Cdc6, МСМ белок не связывается с точкой начала репликации. Во-вторых, у Метазоа, белок Cdt1 негативно регулируется другим белком, геминином, который блокирует его активность во всех периодах, за исключением окна в G1. Наконец, сборка самого pre-RC ограничивается активностью митотического CDK-циклинового комплекса.

Субстратами для этого комплекса являются субъединицы ORC, Cdc6 и МСМ. При фосфорилировании Cdc6 инактивируется, а фосфорилирование белка МСМ в S-фазе вызывает его отщепление от ДНК. Поэтому pre-RC может сформироваться только при низкой активности CDK-циклинового комплекса. Это характерно для промежутка между уровнями высокой активности митотического комплекса CDK-циклина в М-фазе, и в S-фазе, когда она снова увеличивается, способствуя активации точки начала репликации.

Каким образом точка начала репликации переходит из пререпликативного в репликативное состояние? Для такого перехода необходимо формирование многих дополнительных белковых комплексов, и процесс находится под контролем двух киназ, комплекса CDK-циклин и Cdc7-Dbf4 (DDK). Таким образом, активность CDK-циклинового комплекса координирует процессы репликации и клеточного цикла. При этом координация может носить как негативный (предотвращая сборку pre-RC и, таким образом, повторное функционирование точек начала репликации), так и позитивный характер (промотируя активацию точек начала репликации). К числу вопросов, ожидающих своего ответа, относится вопрос относительно субстратов киназ, промотирующих инициацию репликации.

Если комплексы CDK-циклин обеспечивают координацию процессов во всем цикле, то DDK действует на уровне отдельных точек, инициирующих синтез ДНК. К числу наиболее известных субстратов этой киназы относятся сами МСМ-белки. Интересно, что точечная мутация в гене Mcm5 отменяет необходимость присутствия DDK. Это позволяет предполагать, что фосфорилирование приводит к изменению струтуры белка МСМ, что служит причиной инициации репликации. Впрочем, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что эти изменения крайне незначительны. На показаны контрольные процессы репликации ДНК с участием CDK и DDK.

Вероятно, лимитирующим процессом инициации репликации в отдельных начальных точках является связывание белка Cdc45, для которого необходимы как CDK-циклиновый комплекс, так и DDK. Связывание этого белка, которое сопровождается образованием дополнительного комплекса, называемого GINS, приводит к раскручиванию спирали ДНК в начальной точке, за счет активации комплекса МСМ, действующего как хеликаза. Таким образом, МСМ превращается из фактора сборки, участвующего в формировании pre-RC, в фермент хеликазу, который является частью комплекса элонгации. Раскручивание двойной спирали ДНК в точке начала репликации приводит к образованию однонитевой ДНК, которая связывает специфический белок RPA, относящийся к группе белков, связывающихся с однонитевой ДНК (ssDNA binding proteins).

В свою очередь, белок RPA способствует связыванию комплекса праймаза/ДНК-полимераза альфа, который инициирует синтез ДНК. Комплекс МСМ и Cdc45 движется вдоль ДНК, формируя расширяющуюся репликативную вилку, которая образует большую реплисому, включающую в основном ДНК-полимеразу 6, а не полимеразу а. Процессы инициации репликации ДНК представлены на рисунке ниже. В поддержании функционирования реплисомы и защите ДНК в области репликативной вилки от повреждений участвуют контрольные точки и системы репарации ДНК.

Как только МСМ отошли от точки начала репликации, она считается «использованной» и не может активироваться повторно до окончания следующей М-фазы, пока в начальной точке снова не сформируется pre-RC. По мере прохождения S-фазы, МСМ удаляются из хроматина. Наряду с этим, при движении репликативной вилки устанавливаются связи, соединяющие вместе до наступления митоза вновь образованные сестринские хроматиды. Таким образом, завершение S-фазы связано с формированием структур, необходимых для правильной сегрегации хромосом в митозе, что свидетельствует об образовании связей между различными фазами клеточного цикла.

Функция точек начала репликации также регулируется на уровне целой хромосомы. Целесообразно напомнить, что в клетке ДНК с помощью нуклеосом упакована в хроматин, который накладывает на нее ряд структурных ограничений. Это обстоятельство может влиять на временную организацию репликации; например не на всех точках начала в S-фазе репликация происходит в одно и то же время. В некоторых случаях относительное время наступления активации точек начала репликации может определяться не самой точкой, а ее расположением на хромосоме. Точки, расположенные поблизости от транскрипционно-активного эухроматина, инициируются раньше, чем расположенные вблизи транскрипционно-неактивного гетерохроматина, которые обычно инициируются в поздней S-фазе.

Например, точки, расположенные вблизи теломерных областей хромосом (которые обычно транскрипционно неактивны), реплицируются в конце S-фазы. Это общее правило подтверждается изящными экспериментами, выполненными на почкующихся дрожжах. В этих экспериментах перемещение поздней точки начала репликации в эухроматиновую область приводило к ее ранней репликации, и наоборот Однако время наступления начала репликации контролируется также внутренними факторами, присущими самой точке, и роль структуры хроматина и ядра в динамике репликации выяснена недостаточно.

Таким образом, процесс дупликации генома требует интеграции разнообразных сигналов, связывающих вместе регуляторные системы всего клеточного цикла, контролирующие состояние клетки (CDK), и специфические белки хроматина, которые регулируют индивидуальные cis-сайты. Скоординированное действие CDK и DDK демонстрирует, как различные типы киназ обеспечивают выработку конвергентного сигнала, управляющего прохождением клетки по циклу.

Сборка пре-RC происходит в поздней М-фазе и в G1, когда активность CDK и DDK находится на низком уровне.
По мере роста их активности начинается инициация синтеза ДНК.
После инициации npe-RC разбирается и может быть собран повторно, только когда в конце митоза активность CDK снова понизится. Инициация синтеза ДНК регулируется CDK и DDK.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Источник