Что называют обратной генетикой
обратная генетика
Смотреть что такое «обратная генетика» в других словарях:
Обратная генетика — * зваротная генетыка * reverse genetics or surrogate g. 1. Современное направление генетики, сочетающее в себе направленные изменения структуры ДНК () с изучением их фенотипического проявления в конкретной биологической тест системе. Одно из… … Генетика. Энциклопедический словарь
Генетика — Фрагмент ДНК Генетика (от греч. γενητως … Википедия
Обратная транскрипция — Обратная транскрипция это процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно… … Википедия
обратная полимеразная цепная реакция — Модификация метода полимеразной цепной реакции, при которой амплифицируемый участок ДНК получают с помощью рестриктаз endonucleases с последующим замыканием фрагмента в кольцо; О.п.ц.р. позволяет амплифицировать участки ДНК с неизвестной… … Справочник технического переводчика
обратная транскрипция — Синтез ДНК на матрице РНК, осуществляемый с участием обратной транскриптазы. [Арефьев В.А., Лисовенко Л.А. Англо русский толковый словарь генетических терминов 1995 407с.] Тематики генетика EN reverse transcription … Справочник технического переводчика
генетика — [нэ], и; ж. [от греч. genētikos относящийся к рождению, происхождению]. Наука о законах наследственности и изменчивости организмов. Г. человека. Г. растений. Медицинская г. Космическая г. * * * генетика (от греч. génesis происхождение), наука о… … Энциклопедический словарь
Молекулярная генетика — раздел генетики (См. Генетика) и молекулярной биологии (См. Молекулярная биология), ставящий целью познание материальных основ наследственности (См. Наследственность) и изменчивости (См. Изменчивость) живых существ путём исследования… … Большая советская энциклопедия
Список генетических терминов — Эта страница глоссарий. См. также: Список генетических пороков развития и заболеваний Термины генетики в алфавитном поряд … Википедия
Гаплогруппы — Гаплогруппа (в популяционной генетике человека науке, изучающей генетическую историю человечества) группа схожих гаплотипов, имеющих общего предка, у которого в обоих гаплотипах имела место одна и та же мутация однонуклеотидный… … Википедия
Аллели — (от греч. ἀλλήλων друг друга, взаимно) различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом и определяющие альтернативные варианты развития одного и того же признака. В диплоидном… … Википедия
СОДЕРЖАНИЕ
Используемые методы
Направленные делеции и точечные мутации
В некоторых случаях можно использовать условные аллели, чтобы ген функционировал нормально до тех пор, пока условный аллель не будет активирован. Это может повлечь за собой «выбивание» сайтов рекомбиназы (таких как сайты lox или frt), что вызовет делецию в интересующем гене, когда индуцируется специфическая рекомбиназа (такая как CRE, FLP). Рекомбиназы Cre или Flp могут быть индуцированы химическими обработками, обработками тепловым шоком или ограничены определенным подмножеством тканей.
В области вирусологии методы обратной генетики могут использоваться для восстановления полноразмерных инфекционных вирусов с желаемыми мутациями или вставками в вирусные геномы или в специфические вирусные гены. Технологии, которые позволяют эти манипуляции, включают реакцию кольцевого удлинения полимеразы (CPER), которая впервые была использована для создания инфекционной кДНК для вируса Кунджин, близкого родственника вируса Западного Нила. CPER также успешно использовался для создания ряда вирусов с положительной РНК, таких как SARS-CoV-2, возбудитель COVID-19.
Подавление гена
РНКи создает специфический нокаутный эффект без фактической мутации интересующей ДНК. У C. elegans РНКи использовались для систематического вмешательства в экспрессию большинства генов в геноме. РНКи действует, заставляя клеточные системы разрушать информационную РНК-мишень (мРНК).
РНКи-интерференция, особенно подавление гена, стала полезным инструментом для подавления экспрессии генов и выявления и анализа их фенотипа с потерей функции. Когда мутации происходят в аллелях, функция, которую он представляет и кодирует, также мутирует и теряется; это обычно называется мутацией потери функции. Способность анализировать фенотип потери функции позволяет анализировать функцию гена, когда нет доступа к мутантным аллелям.
Вмешательство с использованием трансгенов
В качестве альтернативы можно сверхэкспрессировать мутантные формы гена, которые мешают нормальной функции гена ( дикого типа ). Например, сверхэкспрессия мутантного гена может привести к высоким уровням нефункционального белка, что приведет к доминантному отрицательному взаимодействию с белком дикого типа. В этом случае мутантная версия будет конкурировать за белки-партнеры дикого типа, что приведет к мутантному фенотипу.
Синтез вакцины
Вакцина против гриппа
Преимущества и недостатки
Вакцины, созданные на основе обратной генетики, обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами. В первую очередь это скорость производства. Из-за высокой антигенной изменчивости гликопротеинов HA и NA обратный генетический подход позволяет быстро сформулировать необходимый генотип (т.е. тот, который содержит белки HA и NA, взятые из циркулирующих в настоящее время штаммов вирусов). Кроме того, поскольку конечным продуктом производства ослабленной вакцины с использованием обратной генетики является живой вирус, проявляется более высокая иммуногенность, чем у традиционных инактивированных вакцин, которые должны быть уничтожены с помощью химических процедур перед переносом в качестве вакцины. Однако из-за живой природы аттенуированных вирусов у пациентов с иммунодефицитом могут возникнуть осложнения. Также существует вероятность того, что мутация вируса может привести к тому, что вакцина снова превратится в живой незатухающий вирус.
СОДЕРЖАНИЕ
Используемые методы
Направленные делеции и точечные мутации
В некоторых случаях можно использовать условные аллели, чтобы ген функционировал нормально до тех пор, пока условный аллель не будет активирован. Это может повлечь за собой «выбивание» сайтов рекомбиназы (таких как сайты lox или frt), что вызовет делецию в интересующем гене, когда индуцируется специфическая рекомбиназа (такая как CRE, FLP). Рекомбиназы Cre или Flp могут быть индуцированы химическими обработками, обработками тепловым шоком или ограничены определенным подмножеством тканей.
В области вирусологии методы обратной генетики могут использоваться для восстановления полноразмерных инфекционных вирусов с желаемыми мутациями или вставками в вирусные геномы или в специфические вирусные гены. Технологии, которые позволяют эти манипуляции, включают реакцию кольцевого удлинения полимеразы (CPER), которая впервые была использована для создания инфекционной кДНК для вируса Кунджин, близкого родственника вируса Западного Нила. CPER также успешно использовался для создания ряда вирусов с положительной РНК, таких как SARS-CoV-2, возбудитель COVID-19.
Подавление гена
РНКи создает специфический нокаутный эффект без фактической мутации интересующей ДНК. У C. elegans РНКи использовались для систематического вмешательства в экспрессию большинства генов в геноме. РНКи действует, заставляя клеточные системы разрушать информационную РНК-мишень (мРНК).
РНКи-интерференция, особенно подавление гена, стала полезным инструментом для подавления экспрессии генов и выявления и анализа их фенотипа с потерей функции. Когда мутации происходят в аллелях, функция, которую он представляет и кодирует, также мутирует и теряется; это обычно называется мутацией потери функции. Способность анализировать фенотип потери функции позволяет анализировать функцию гена, когда нет доступа к мутантным аллелям.
Вмешательство с использованием трансгенов
В качестве альтернативы можно сверхэкспрессировать мутантные формы гена, которые мешают нормальной функции гена ( дикого типа ). Например, сверхэкспрессия мутантного гена может привести к высоким уровням нефункционального белка, что приведет к доминантному отрицательному взаимодействию с белком дикого типа. В этом случае мутантная версия будет конкурировать за белки-партнеры дикого типа, что приведет к мутантному фенотипу.
Синтез вакцины
Вакцина против гриппа
Преимущества и недостатки
Вакцины, созданные на основе обратной генетики, обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами. В первую очередь это скорость производства. Из-за высокой антигенной изменчивости гликопротеинов HA и NA обратный генетический подход позволяет быстро сформулировать необходимый генотип (т.е. тот, который содержит белки HA и NA, взятые из циркулирующих в настоящее время штаммов вирусов). Кроме того, поскольку конечным продуктом производства ослабленной вакцины с использованием обратной генетики является живой вирус, проявляется более высокая иммуногенность, чем у традиционных инактивированных вакцин, которые должны быть уничтожены с помощью химических процедур перед переносом в качестве вакцины. Однако из-за живой природы аттенуированных вирусов у пациентов с иммунодефицитом могут возникнуть осложнения. Также существует вероятность того, что мутация вируса может привести к тому, что вакцина снова превратится в живой незатухающий вирус.
Обратная генетика это метод в молекулярная генетика который используется, чтобы помочь понять функцию (ы) ген анализируя фенотипический эффекты, вызванные генная инженерия специфический последовательности нуклеиновых кислот внутри гена. Процесс идет в обратном направлении вперед генетический экраны классическая генетика. В то время как передовая генетика пытается найти генетическую основу фенотип или признака, обратная генетика пытается выяснить, какие фенотипы контролируются конкретными генетическими последовательностями.
Автоматизированный Секвенирование ДНК генерирует большие объемы геномный последовательность данные относительно быстро. Многие генетические последовательности обнаруживаются раньше, чем другая, менее доступная биологическая информация. Обратная генетика пытается связать данную генетическую последовательность со специфическим воздействием на организм. [1]
Содержание
Используемые методы
Чтобы узнать, какое влияние оказывает последовательность на фенотип, или выяснить ее биологическую функцию, исследователи могут спроектировать изменение или нарушить ДНК. После того, как это изменение было внесено, исследователь может искать влияние таких изменений в целом. организм. Существует несколько различных методов обратной генетики:
Направленные делеции и точечные мутации
Сайт-направленный мутагенез это сложный метод, который может либо изменить регуляторные регионы в промоутер гена или сделать тонкий кодон изменения в открытая рамка чтения для определения важных аминокислотных остатков для белок функция. [ нужна цитата ]
Как вариант, технику можно использовать для создания нулевые аллели так что ген не работает. Например, удаление гена нацеливание на гены (нокаут гена) может происходить с некоторыми организмами, такими как дрожжи, мышей и мох. Уникальный среди растений, в Physcomitrella patens, нокаут гена через гомологичная рекомбинация создавать нокаутный мох (см. рисунок) почти так же эффективен, как и дрожжи. [3] В случае модели дрожжей, направленные делеции были созданы в каждом несущественном гене в геноме дрожжей. [4] В случае с заводом модельная система огромные библиотеки мутантов были созданы на основе конструкций разрушения генов. [5] В генная нокаутация, эндогенный экзон заменяется измененной представляющей интерес последовательностью. [6]
В некоторых случаях можно использовать условные аллели, чтобы ген функционировал нормально до тех пор, пока условный аллель не будет активирован. Это может повлечь за собой «стук в» рекомбиназа сайты (такие как lox или frt), которые вызовут делецию в интересующем гене, когда индуцируется специфическая рекомбиназа (такая как CRE, FLP). Рекомбиназы Cre или Flp могут быть индуцированы с помощью химических обработок, обработок тепловым шоком или могут быть ограничены определенным набором тканей. [ нужна цитата ]
Другой метод, который можно использовать, это ОБРАБОТКА. Это метод, сочетающий в себе стандартный и эффективный метод мутагенеза с химическим мутагеном, таким как этилметансульфонат (EMS) с чувствительной техникой ДНК-скрининга, которая определяет точечные мутации в целевом гене. [ нужна цитата ]
Подавление гена
Открытие подавление гена с использованием двухцепочечной РНК, также известной как РНК-интерференция (РНКи), и разработка нокдауна гена с использованием Морфолино oligos, сделали нарушение экспрессии генов доступной техникой для многих исследователей. Этот метод часто называют нокдаун генов так как действие этих реагентов обычно временное, в отличие от нокауты генов которые являются постоянными. [ нужна цитата ]
РНКи создает специфический нокаутный эффект без фактической мутации интересующей ДНК. В C. elegans, РНКи использовались для систематического вмешательства в экспрессию большинства генов в геноме. РНКи действует, направляя клеточные системы на разрушение информационной РНК-мишени (мРНК). [ нужна цитата ]
РНКи-интерференция, в частности подавление гена, стала полезным инструментом для подавления экспрессии генов и выявления и анализа их фенотипа потери функции. Когда мутации происходят в аллелях, функция, которую он представляет и кодирует, также мутирует и теряется; это обычно называется мутацией потери функции. [7] Способность анализировать фенотип потери функции позволяет анализировать функцию гена, когда нет доступа к мутантным аллелям. [8]
Пока РНК-интерференция эффективность зависит от клеточных компонентов (например, белков Dicer, комплекса RISC), простой альтернативой нокдауну гена является Морфолино антисмысловые олигонуклеотиды. Морфолино связываются и блокируют доступ к целевой мРНК, не требуя активности клеточных белков и не обязательно ускоряя деградацию мРНК. Морфолино эффективны в системах различной сложности от бесклеточной трансляции в пробирке до in vivo исследования на крупных животных моделях. [ нужна цитата ]
Вмешательство с использованием трансгенов
В качестве альтернативы можно сверхэкспрессировать мутантные формы гена, которые мешают нормальному (дикого типа) функция гена. Например, сверхэкспрессия мутантного гена может привести к высоким уровням нефункционального белка, что приводит к доминирующий отрицательный взаимодействие с белком дикого типа. В этом случае мутантная версия будет конкурировать за белки-партнеры дикого типа, что приведет к мутантному фенотипу.
Другие мутантные формы могут привести к образованию белка, который ненормально регулируется и является конститутивно активным (постоянно активным). Это может быть связано с удалением регуляторного домена или мутацией определенного аминокислотного остатка, который обратимо модифицируется (путем фосфорилирование, метилирование, или же убиквитинирование). Любое изменение имеет решающее значение для модуляции функции белка и часто приводит к информативным фенотипам.
Синтез вакцины
Обратная генетика играет большую роль в вакцина синтез. Вакцины могут быть созданы путем конструирования новых генотипов инфекционных вирусных штаммов, которые уменьшают их патогенную активность в достаточной степени, чтобы усилить иммунитет у хозяина. Обратный генетический подход к синтезу вакцины использует известные вирусные генетические последовательности для создания желаемого фенотипа: вирус с ослабленной патологической активностью и сходством с текущим циркулирующим штаммом вируса. Обратная генетика обеспечивает удобный подход к традиционному методу создания инактивированные вакцины, вирусы, уничтоженные с помощью тепла или других химических методов.
Вакцины, созданные с помощью методов обратной генетики, известны как аттенуированные вакцины, названные потому, что они содержат ослабленные (аттенуированные) живые вирусы. Аттенуированные вакцины создаются путем объединения генов нового или существующего штамма вируса с ранее ослабленными вирусами того же вида. [9] Аттенуированные вирусы создаются путем размножения живого вируса в новых условиях, например, в курином яйце. Это производит вирусный штамм, который все еще жив, но не патоген для человека. [10] поскольку эти вирусы оказываются дефектными в том смысле, что они не могут реплицировать свой геном в достаточной степени, чтобы размножаться и в достаточной степени инфицировать хозяина. Однако вирусные гены все еще экспрессируются в клетке-хозяине в течение одного цикла репликации, что позволяет развить иммунитет. [11]
Вакцина против гриппа
кДНК-последовательности вирусной РНК синтезируются из аттенуированных основных штаммов с использованием ОТ-ПЦР. [9] Затем эту кДНК можно вставить между промотором РНК-полимеразы I (Pol I) и последовательностью терминатора. Затем последовательность кДНК и pol I, в свою очередь, окружается промотором РНК-полимеразы II (Pol II) и полиаденилирование сайт. [12] Затем всю эту последовательность вставляют в плазмиду. Шесть плазмид, полученных из кДНК аттенуированного основного штамма, котрансфицируют в клетку-мишень, часто в куриное яйцо, вместе с двумя плазмидами циркулирующего в настоящее время штамма гриппа дикого типа. Внутри клетки-мишени два «уложенных друг на друга» фермента Pol I и Pol II транскрибируют вирусную кДНК для синтеза как вирусной РНК с отрицательным смыслом, так и мРНК с положительным смыслом, эффективно создавая аттенуированный вирус. [9] В результате получается дефектный штамм вакцины, который похож на текущий штамм вируса, что позволяет хозяину вырабатывать иммунитет. Этот синтезированный вакцинный штамм можно затем использовать в качестве посевного вируса для создания дополнительных вакцин.
Преимущества и недостатки
Обратная генетика это метод в молекулярная генетика который используется, чтобы помочь понять функцию (ы) ген анализируя фенотипический эффекты, вызванные генная инженерия специфический последовательности нуклеиновых кислот внутри гена. Процесс идет в обратном направлении вперед генетический экраны классическая генетика. В то время как передовая генетика пытается найти генетическую основу фенотип или признака, обратная генетика пытается выяснить, какие фенотипы контролируются конкретными генетическими последовательностями.
Автоматизированный Секвенирование ДНК генерирует большие объемы геномный последовательность данные относительно быстро. Многие генетические последовательности обнаруживаются раньше, чем другая, менее доступная биологическая информация. Обратная генетика пытается связать данную генетическую последовательность со специфическим воздействием на организм. [1]
Содержание
Используемые методы
Чтобы узнать, какое влияние оказывает последовательность на фенотип, или выяснить ее биологическую функцию, исследователи могут спроектировать изменение или нарушить ДНК. После того, как это изменение было внесено, исследователь может искать влияние таких изменений в целом. организм. Существует несколько различных методов обратной генетики:
Направленные делеции и точечные мутации
Сайт-направленный мутагенез это сложный метод, который может либо изменить регуляторные регионы в промоутер гена или сделать тонкий кодон изменения в открытая рамка чтения для определения важных аминокислотных остатков для белок функция. [ нужна цитата ]
Как вариант, технику можно использовать для создания нулевые аллели так что ген не работает. Например, удаление гена нацеливание на гены (нокаут гена) может происходить с некоторыми организмами, такими как дрожжи, мышей и мох. Уникальный среди растений, в Physcomitrella patens, нокаут гена через гомологичная рекомбинация создавать нокаутный мох (см. рисунок) почти так же эффективен, как и дрожжи. [3] В случае модели дрожжей, направленные делеции были созданы в каждом несущественном гене в геноме дрожжей. [4] В случае с заводом модельная система огромные библиотеки мутантов были созданы на основе конструкций разрушения генов. [5] В генная нокаутация, эндогенный экзон заменяется измененной представляющей интерес последовательностью. [6]
В некоторых случаях можно использовать условные аллели, чтобы ген функционировал нормально до тех пор, пока условный аллель не будет активирован. Это может повлечь за собой «стук в» рекомбиназа сайты (такие как lox или frt), которые вызовут делецию в интересующем гене, когда индуцируется специфическая рекомбиназа (такая как CRE, FLP). Рекомбиназы Cre или Flp могут быть индуцированы с помощью химических обработок, обработок тепловым шоком или могут быть ограничены определенным набором тканей. [ нужна цитата ]
Другой метод, который можно использовать, это ОБРАБОТКА. Это метод, сочетающий в себе стандартный и эффективный метод мутагенеза с химическим мутагеном, таким как этилметансульфонат (EMS) с чувствительной техникой ДНК-скрининга, которая определяет точечные мутации в целевом гене. [ нужна цитата ]
Подавление гена
Открытие подавление гена с использованием двухцепочечной РНК, также известной как РНК-интерференция (РНКи), и разработка нокдауна гена с использованием Морфолино oligos, сделали нарушение экспрессии генов доступной техникой для многих исследователей. Этот метод часто называют нокдаун генов так как действие этих реагентов обычно временное, в отличие от нокауты генов которые являются постоянными. [ нужна цитата ]
РНКи создает специфический нокаутный эффект без фактической мутации интересующей ДНК. В C. elegans, РНКи использовались для систематического вмешательства в экспрессию большинства генов в геноме. РНКи действует, направляя клеточные системы на разрушение информационной РНК-мишени (мРНК). [ нужна цитата ]
РНКи-интерференция, в частности подавление гена, стала полезным инструментом для подавления экспрессии генов и выявления и анализа их фенотипа потери функции. Когда мутации происходят в аллелях, функция, которую он представляет и кодирует, также мутирует и теряется; это обычно называется мутацией потери функции. [7] Способность анализировать фенотип потери функции позволяет анализировать функцию гена, когда нет доступа к мутантным аллелям. [8]
Пока РНК-интерференция эффективность зависит от клеточных компонентов (например, белков Dicer, комплекса RISC), простой альтернативой нокдауну гена является Морфолино антисмысловые олигонуклеотиды. Морфолино связываются и блокируют доступ к целевой мРНК, не требуя активности клеточных белков и не обязательно ускоряя деградацию мРНК. Морфолино эффективны в системах различной сложности от бесклеточной трансляции в пробирке до in vivo исследования на крупных животных моделях. [ нужна цитата ]
Вмешательство с использованием трансгенов
В качестве альтернативы можно сверхэкспрессировать мутантные формы гена, которые мешают нормальному (дикого типа) функция гена. Например, сверхэкспрессия мутантного гена может привести к высоким уровням нефункционального белка, что приводит к доминирующий отрицательный взаимодействие с белком дикого типа. В этом случае мутантная версия будет конкурировать за белки-партнеры дикого типа, что приведет к мутантному фенотипу.
Другие мутантные формы могут привести к образованию белка, который ненормально регулируется и является конститутивно активным (постоянно активным). Это может быть связано с удалением регуляторного домена или мутацией определенного аминокислотного остатка, который обратимо модифицируется (путем фосфорилирование, метилирование, или же убиквитинирование). Любое изменение имеет решающее значение для модуляции функции белка и часто приводит к информативным фенотипам.
Синтез вакцины
Обратная генетика играет большую роль в вакцина синтез. Вакцины могут быть созданы путем конструирования новых генотипов инфекционных вирусных штаммов, которые уменьшают их патогенную активность в достаточной степени, чтобы усилить иммунитет у хозяина. Обратный генетический подход к синтезу вакцины использует известные вирусные генетические последовательности для создания желаемого фенотипа: вирус с ослабленной патологической активностью и сходством с текущим циркулирующим штаммом вируса. Обратная генетика обеспечивает удобный подход к традиционному методу создания инактивированные вакцины, вирусы, уничтоженные с помощью тепла или других химических методов.
Вакцины, созданные с помощью методов обратной генетики, известны как аттенуированные вакцины, названные потому, что они содержат ослабленные (аттенуированные) живые вирусы. Аттенуированные вакцины создаются путем объединения генов нового или существующего штамма вируса с ранее ослабленными вирусами того же вида. [9] Аттенуированные вирусы создаются путем размножения живого вируса в новых условиях, например, в курином яйце. Это производит вирусный штамм, который все еще жив, но не патоген для человека. [10] поскольку эти вирусы оказываются дефектными в том смысле, что они не могут реплицировать свой геном в достаточной степени, чтобы размножаться и в достаточной степени инфицировать хозяина. Однако вирусные гены все еще экспрессируются в клетке-хозяине в течение одного цикла репликации, что позволяет развить иммунитет. [11]
Вакцина против гриппа
кДНК-последовательности вирусной РНК синтезируются из аттенуированных основных штаммов с использованием ОТ-ПЦР. [9] Затем эту кДНК можно вставить между промотором РНК-полимеразы I (Pol I) и последовательностью терминатора. Затем последовательность кДНК и pol I, в свою очередь, окружается промотором РНК-полимеразы II (Pol II) и полиаденилирование сайт. [12] Затем всю эту последовательность вставляют в плазмиду. Шесть плазмид, полученных из кДНК аттенуированного основного штамма, котрансфицируют в клетку-мишень, часто в куриное яйцо, вместе с двумя плазмидами циркулирующего в настоящее время штамма гриппа дикого типа. Внутри клетки-мишени два «уложенных друг на друга» фермента Pol I и Pol II транскрибируют вирусную кДНК для синтеза как вирусной РНК с отрицательным смыслом, так и мРНК с положительным смыслом, эффективно создавая аттенуированный вирус. [9] В результате получается дефектный штамм вакцины, который похож на текущий штамм вируса, что позволяет хозяину вырабатывать иммунитет. Этот синтезированный вакцинный штамм можно затем использовать в качестве посевного вируса для создания дополнительных вакцин.