Что относится к световой микроскопии
Светлопольная (световая) микроскопия
Современная микроскопия имеет большое количество методов, на основании которых функционируют самые различные микроскопы, сферы применения которых весьма различны. И часто возникают споры и дилеммы о том, что же лучше: световой или, как его еще называют, оптический микроскоп, либо же электронный.
Стоит сразу отметить некоторый момент – это частая путаница в понятиях таких, как электронный микроскоп и микроскоп цифровой. Именно эти понятия так часто можно увидеть, когда их употребляют в неуместном варианте.
Строение светового микроскопа
В зависимости от комплектации световые микроскопы могут быть как самыми примитивными (например, которые используются в кабинетах физики в школе), так и состоять из сложных систем современного образца.
Из чего же состоит световой микроскоп? По структуре световой микроскоп имеет такие основные части:
Объект исследования получается увеличенным именно благодаря совместному воздействию таких структур микроскопа как: окуляр, объектив и зеркало. Технические аспекты обеспечивают все остальные составляющие микроскопа.
Благодаря окуляру, который находится в верхней части микроскопа, человеческий глаз наблюдает объект. В состав окуляра входят несколько увеличительных линз, заключенных в оправу. Нижняя линза окуляра отвечает за фокусировку объекта исследования, а верхняя линза обеспечивает процесс наблюдения. Окуляры обладают сравнительно малой степенью увеличения.
Важным параметром в выборе окуляра микроскопа является вынос зрачка, расстояние между глазом и отверстием окуляра. Если специалист будет работать с микроскопом в очках, то стоит выбирать микроскоп с большим выносом, равным 10-20 мм.
Трубка в форме цилиндра, к которой крепится окуляр, называют тубусом. В верхней части тубуса расположен окуляр, а в нижней части – устройство для крепления объективов. Движение тубуса обеспечивается винтами на штативе микроскопа. Такое движение тубуса определяет возможность контролировать расстояние до объекта исследования на предметном столике.
Сравнение электронного и светового микроскопа
Цифровые микроскопы – это лишь оборудование, которое выводит получаемое изображение из оптического микроскопа на экран монитора компьютера, при помощи чего исследователь может детально рассмотреть нюансы объекта. А электронный микроскоп имеет совершенно иной метод получения изображения: через объект проходят не световые лучи, а электроны, которые, ударяясь о поверхность объекта, формируют нюансы его поверхности и структурных особенностей. Они строят геометрический образ изучаемого объекта.
Конечно же, у оптического микроскопа есть свои преимущества, а также недостатки. Однако, каждый покупатель, выбирая такое оборудование, должен отталкиваться от его потребностей, а также сферы, в которой будет работать микроскоп, от направленности лаборатории.
Если речь идет о базовых задачах микроскопа, как, например, его использование в лаборатории школы института, которое обусловливает обучающие цели, тогда, конечно же, выбор падает на оптический (световой) микроскоп. В световой микроскоп можно увидеть все, чего требует базовая школьная программа по биологии.
Естественно, что покупка для таких целей какого-либо другого типа и класса оборудования просто необоснованно. Если же речь идет о какой-либо исследовательской лаборатории, где необходимы нюансы микроскопического строения объекта, как, например, в области вирусологии, криобиологии, томографии, либо нейрохирургии или же других узкоспециализированных областей, тогда, естественно, световой микроскоп будет неуместен для использования в таких направлениях деятельности.
Что это означает: преимущества светового микроскопа? Это означает лишь одно – о преимуществах либо недостатках конкретного вида микроскопа можно говорить только опираясь на сферу, в которой он будет использоваться. Так как. Например, в школьном кабинете биологии просто нецелесообразно использование дорогого, практически недоступного электронного микроскопа, когда можно использовать дешевый световой прибор, а в научно-исследовательском институте просто недопустимо и бесполезно будет использование оптического простого микроскопа, который попросту не даст никаких результатов в конкретной научной деятельности, так как его увеличения и разрешения просто не будет хватать для такой работы.
Преимущество светового микроскопа перед электронным
Если попросить работника лаборатории «определи преимущество использования световой микроскопии перед электронной», то даже начинающий исследователь сможет назвать основные плюсы работы с таким видом оборудования.
Методы световой микроскопии
Световая, или оптическая, микроскопия — это один из основных методов исследования частиц, неразличимых человеческим глазом. Данный метод имеет широкое распространение в медицине, фармакологии, биологии, металлографии, криминалистике и других сферах.
Увеличение изображения в световом микроскопе обеспечивается системой собирательных линз, расположенных в окуляре и объективе.
Метод световой микроскопии
Предельная разрешающая способность человеческого глаза составляет около 0,1 мм. Это понятие отражает минимальное расстояние, на котором 2 соседние точки определяются как отдельные объекты. Микрочастицы, клеточные структуры и дефекты поверхности имеют размер менее 100 мкм, поэтому для их исследования требуется специальное оборудование.
Историческая справка
Первые оптические микроскопы были изобретены в XVI-XVII вв. Первым, кто заметил увеличительный эффект комбинации из нескольких линз, был венецианский врач Джироламо Фракасторо. В 1609 г. Галилео Галилей представил собственный вариант прибора с 2 стеклами: выпуклым и вогнутым. Первое устройство называлось оккиолино (occhiolino).
Практическое применение микроскопа началось с конца XVII в., когда Антони Ван Левенгук использовал собственное оптическое устройство для исследования биологических структур. Его микроскоп содержал всего одно мощное стекло, что уменьшало количество дефектов картинки.
Приборы Левенгука позволяли увеличить изображение в 275 раз и рассмотреть строение бактерий, дрожжей, эритроцитов, одноклеточных микроорганизмов и насекомых.
Популяризации микроскопии способствовала и книга английского исследователя Роберта Гука, которая вышла в 1664 г. В ней ученый ввел термин «клетка» и опубликовал гравюры некоторых микрообъектов.
В течение следующих столетий конструкция оптического микроскопа непрерывно совершенствовалась. Несмотря на то, что в первой половине XX в. были изобретены электронные приборы, которые позволяли рассмотреть нанообъекты, световой метод не теряет своей популярности. В 2006 г. группа немецких ученых разработала оптическое устройство под названием наноскоп, которое обладает разрешающей способностью 10 нм.
Подробно о принципе действия
Принцип работы оптического микроскопа основывается на прохождении прямого или отраженного луча света через систему линз.
Объектив прибора содержит до 14 стекол. При прохождении светового пучка через эту часть устройства изображение увеличивается до 100 раз, а при прохождении окуляра — в 20-24 раза. Выпуклые и вогнутые стекла позволяют сфокусировать картинку на сетчатке или приспособлениях для документирования информации.
Видимое излучение, которое создает осветительная система прибора, ограничивают несколькими диафрагмами. Это повышает четкость изображения.
Увеличивающие линзы имеют 2 дефекта. Сферическая аберрация мешает фокусировать сразу все поле исследования, а хроническая приводит к появлению яркой каймы по контуру изображения. Чтобы компенсировать дефекты, окуляр и объектив оснащаются корригирующими стеклами.
Где применяется
Методы световой микроскопии применяют в следующих областях науки и промышленности:
В целом об устройстве светового микроскопа
Оптический микроскоп состоит из следующих элементов:
Некоторые модели прибора оборудованы дополнительными объективами, системами записи и передачи информации.
Виды световых микроскопов с описанием
Особенности конструкции зависят от предназначения микроскопа. Для увеличения четкости изображения используют методы флуоресценции, люминесценции, инверсии и др.
Биологическое оборудование
Биологические приборы позволяют исследовать прозрачные или полупрозрачные объекты. Принцип их работы основан на изучении светлого поля в потоке проходящего света. Такие микроскопы применяют в лабораторной диагностике, ботанике, цитологии, микроэлектронике, археологии и пищевой промышленности.
Для повышения разрешающей способности используют иммерсионные оптические системы. В этом случае между образцом и первым стеклом вводится жидкость с высоким коэффициентом преломления (минеральное масло, раствор глицерина, дистиллированная вода и др.).
Криминалистическое оборудование
Главная особенность криминалистического микроскопа — это возможность сравнения 2 объектов. Такое исследование помогает найти сходство между компонентами взрывных устройств, гильзами, пулями, волосами, волокнами и другими уликами.
Приборы для криминалистики оснащают фото- и видеокамерами, а также программным обеспечением.
Это позволяет снизить вероятность ошибок, построить модели объектов и сравнить с данными из электронных источников.
Флуоресцентные микроскопы
Флуоресцентные, или люминесцентные, микроскопы позволяют исследовать объекты, которые испускают световой поток после облучения ультрафиолетом. Они оборудованы коротковолновым источником освещения, светофильтрами и интерференционной пластинкой.
Флуоресцентные микроскопы активно применяют в лабораторной диагностике, в частности, при изучении клеток крови и антигенов. Для анализа предметов, которые не излучают свет, используют люминесцентные красители и порошки.
Поляризационные микроскопы
Поляризационный прибор является наиболее сложным из всех представленных видов микроскопов. Его используют для исследования анизотропных материалов, полимеров, некоторых клеток и микробиологических объектов.
Источник света со специальными фильтрами формирует поляризованный поток, который облучает образец.
Оптическая система интерпретирует двойное лучепреломление среды и позволяет изучить ее структуру.
Инвертированные с перевернутым положением объектива
В инвертированном микроскопе объектив располагается не над образцом, а под предметным столиком. Такие приборы применяют в биологии, медицине, промышленности, металлографии, криминалистике и других сферах.
Перевернутое положение оптической системы позволяет изучать более крупные образцы и работать со специальной посудой.
Микроскопы для металлографии
Металлографические микроскопы предназначены для исследования поверхности непрозрачных объектов. Изображение получают путем преломления отраженного светового луча.
Предметом изучения являются микродефекты поверхности и зерна сплавов. Помимо металлургии и промышленности, такие устройства применяют в геологии и археологии. Для обеспечения четкости используют специальные системы линз и зеркал.
Стереомикроскопы (дают объемное изображение)
Стереомикроскопы оснащены 2 объективами, что позволяет получать объемное изображение исследуемого образца. По сравнению с устройствами плоского поля они дают более резкую, четкую и контрастную картинку.
Такие приборы используют в точном машиностроении, ювелирном деле и других областях промышленности.
Моновидеомикроскопы с возможностью получения видео
Видеомикроскопы предназначены для динамического наблюдения за образцом и фиксации изображения. Для повышения эффективности работы их оснащают специальными линзами, светофильтрами и адаптерами.
Разновидности методов световой микроскопии
Выбор метода оптической микроскопии определяется особенностями объектов и целью исследования.
Светлое поле в потоке проходящего света
Данный метод основан на принципе прохождения потока света через образец. Предмет частично поглощает и рассеивает попадающие на него лучи, что позволяет сформировать изображение.
Светлопольную микроскопию применяют для изучения окрашенных тканей животных и растений, тонких шлифов и др. Для прохождения светового пучка препарат должен быть прозрачным.
Косое освещение
Данный метод является разновидностью микроскопии светлого поля. Чтобы выявить рельеф и сделать изображение более контрастным, поток направляют под большим углом к образцу.
Светлое поле в отраженном свете
Светопольная микроскопия в отраженном свете позволяет исследовать поверхности непрозрачных предметов (сплавов, покрытий, руд и др.). Свет падает на образец сверху, а основная оптическая система исполняет роль объектива и конденсора.
Изображение формируется за счет того, что элементы поверхности по-разному отражают и рассеивают попадающие лучи. Травление дает возможность изучить не только дефекты, но и микроструктуру и фазовый состав образца.
Темное поле
Метод темного поля предназначен для изучения прозрачных образцов, которые не абсорбируют свет. Специальный конденсор направляет лучи так, что они формируют полый конус, в центре которого находится объектив. Таким образом, большая часть лучей не попадает в оптическую систему.
Изображение представляет собой темное поле с небольшими светлыми включениями, которые формируются за счет рассеяния света частицами препарата.
Ультрамикроскопия
Метод ультрамикроскопии является разновидностью темнопольного. Для исследования образцов используют сильные источники света, а лучи направляют перпендикулярно предметному столу. Эффект рассеяния волн позволяет обнаружить частицы менее 10 нм.
Фазовое контрастирование
Метод фазового контраста позволяет изучать прозрачные и неокрашенные образцы. При малом различии в коэффициенте преломления изображение нельзя получить ни на светлопольном, ни на темнопольном микроскопе, поскольку разница в поглощении и рассеянии света будет минимальной.
Однако при прохождении через образец волна приобретает фазовый рельеф, который фиксируется специальным объективом. В изображении он отображается как различие в яркости элементов.
Аноптральный контраст
Данная методика является подвидом фазовой микроскопии. На иммерсионную линзу наносят кольцо из сажи, которое пропускает 10% лучей и совпадает с контуром кольцевой диафрагмы конденсора. При отсутствии образца амплитуда световых волн уменьшается на 90%.
Проходя через среды разной плотности, лучи дифрагируют, в результате чего их амплитуда остается неизменной.
За счет этого поле исследования получается темным, а частицы образца — светлыми.
Поляризационный метод
Анализ анизотропных материалов проводят в свете, пропущенном через специальную фильтрующую пластинку. При прохождении через образец плоскость поляризации лучей меняется.
По разнице между начальными и конечными характеристиками волн определяют количество оптических осей, их ориентацию и др.
Интерференционная микроскопия
Интерференционный метод основан на параллельном прохождении 2 лучей через предметный столик и мимо него. В окуляре микроскопа когерентные волны соединяются и интерферируют между собой.
При прохождении через образец первый луч запаздывает по фазе, что влияет на результирующую амплитуду и яркость изображения.
Люминесценция или флуоресценция
Принцип люминесцентной микроскопии основан на том, что некоторые образцы испускают видимый свет после облучения ультрафиолетом. Перед исследованием препараты обрабатывают флуоресцирующими антисыворотками, порошками или маркерами.
Волны ультрафиолетового спектра применяют для повышения разрешающей способности микроскопа. Для изучения препаратов, которые не испускают видимый свет после воздействия УФ-лучей, используют фотокамеры и кварцевые линзы.
Оптическая микроскопия (световая)
Под оптической микроскопией (световой) понимается многообразие методов изучения микрообъектов при помощи оптических микроскопов разных конструкций. Кроме нее существует еще и электронная микроскопия, но в рамках этой статьи мы ее рассматривать не будем. Оптический микроскоп позволяет наблюдать объекты на увеличении до 2000–3000 крат, причем размер этих объектов не может быть меньше 200–400 нм (1 нм = 10−9 м = 10−6 мм). Эти ограничения накладывают физические законы – преодолеть эти границы можно лишь с применением неоптических (электронных) систем.
Методы оптической микроскопии
Метод микроскопии, который исследователь выбирает для изучения образца, зависит и от структуры самого образца, и от условий наблюдений, и от задач, которые решает наблюдатель. Принято выделять следующие методы: светлого поля, темного поля, поляризационную микроскопию, люминесцентную (флуоресцентную) микроскопию, метод фазового контраста и некоторые другие. Большинство этих методов мы описывали в отдельных статьях, которые можно найти по ссылке.
Сканирующая оптическая микроскопия
Здесь же мы осветим менее распространенный метод, который был разработан ирландским физиком Эдвардом Сингом в 1928 году. К сожалению, этот вид микроскопии не был встречен с энтузиазмом учеными того времени. Первые опыты с его использованием провели лишь в 1972 году. Этот метод называется «ближнепольная оптическая микроскопия», часто можно встретить и дополнение «сканирующая». На сегодняшний день это один из широко используемых в профессиональных кругах способов наблюдения микромира. Для исследований применяются специальные микроскопы со сканирующими оптическими зондами. Зонд позволяет регистрировать электромагнитное поле с расстояния меньшего, чем длина световой волны. И, несмотря на то, что наблюдения ведутся в оптическом диапазоне, разрешение (четкость и контрастность) картинки при сканирующей оптической микроскопии во много раз превышают разрешение изображений, полученных с использованием классических микроскопов.
Все микроскопы, которые представлены в нашем интернет-магазине, вы можете найти по ссылке. Наши консультанты всегда готовы помочь советом – звоните или пишите, если затрудняетесь с выбором подходящего микроскопа или аксессуаров.
Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.
Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.
СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
Чтобы понять, насколько незаменим микроскоп в микробиологических исследованиях, нужно вспомнить об ограничениях, присущих глазу как оптическому прибору. Видимая величина объекта прямо пропорциональна углу, под которым этот предмет рассматривается. Значит, если расстояние от глаза до объекта уменьшится вдвое, то видимые размеры объекта увеличатся вдвое. Однако глаз человека не может сфокусироваться на предметах, находящихся от него на расстоянии меньше примерно 25 см. Это и есть то расстояние, на котором достигается максимальная разрешающая способность. Чтобы вообще можно было увидеть объект, его угловые размеры должны быть не менее 1′. При расстоянии в 25 см это соответствует частице величиной около 0,1 мм.
Большинство клеток (а значит, и большинство одноклеточных организмов) слишком малы, чтобы их можно было увидеть невооруженным глазом. Поэтому для того, чтобы обнаружить такие организмы и рассмотреть их форму и строение, необходим микроскоп. Назначение системы линз этого прибора, расположенных между объектом и глазом, состоит в том, чтобы увеличить кажущийся угол, под которым виден объект в поле микроскопа. Помимо увеличения, большое значение имеют также контрастность и разрешение. Чтобы объект можно было различить под микроскопом, необходима определенная степень контраста между этим объектом и окружающим фоном, а для получения четкого увеличенного изображения микроскоп должен обладать достаточной разрешающей способностью, которая позволяла бы раздельно воспринимать очень близкие точки изображения.
Антони ван Левенгук открыл мир микробов, пользуясь простыми микроскопами с одной короткофокусной двояковыпуклой линзой. Для разработки используемых теперь сложных микроскопов и их усовершенствования потребовалось почти два века исследований по прикладной оптике.
В современном сложном микроскопе имеются три отдельные системы линз. Конденсор, расположенный между источником света и объектом, собирает лучи света в поле микроскопа.
Простым линзам присущи два оптических дефекта. Они неспособны сфокусировать одновременно все поле микроскопа (сферическая аберрация) и создают окрашенную кайму вокруг изображения (хроматическая аберрация). Эти дефекты можно почти полностью устранить, поместив рядом с основной линзой дополнительные корригирующие линзы. Поэтому и объектив, и окуляр современного сложного микроскопа составляют из нескольких линз, чтобы свести эти аберрации к минимуму.
Для получения четкого изображения очень важно правильно отрегулировать кон-денсорную линзу. При использовании больших увеличений необходимо установить конденсор так, чтобы обеспечить критическое освещение поля микроскопа: лучи света от источника должны фокусироваться в плоскости объекта, а световое поле должно занимать линзу объектива почти полностью.
Предел разрешающей способности
Максимальное полезное увеличение, достижимое с помощью светового микроскопа, определяется физическими свойствами света. Так как свет имеет волновую природу, очень малый объект будет виден в микроскоп как диск, окруженный рядом светлых и темных колец. Две соседние точки объекта можно «разрешить», т. е. они будут восприниматься раздельно, только в том случае, если эти окружающие их кольца не перекрываются. Пределом разрешения называется наименьшее расстояние между двумя точками, при котором их еще можно видеть раздельно. Именно этим расстоянием и определяется максимальное полезное увеличение светового микроскопа.
Контраст в световом микроскопе и его повышение
Мелкие живые биологические объекты, например клетки микробов, рассматривают под микроскопом обычно в тонком слое водной среды, заключенном между предметным и покровным стеклами. При этом видимость объекта обусловлена тем, что он пропускает света меньше, чем окружающая его среда, и в результате между объектом и средой создается некоторый контраст. Объект пропускает меньше света, во-первых, потому, что часть света поглощается клеткой, и во-вторых, потому, что часть его выводится из оптического пути микроскопа в результате различия в показателях преломления клетки и окружающей среды. Если не считать некоторых сильно окрашенных структур (каковы, например, хлоропласты), биологические объекты обычно очень слабо поглощают в видимой области спектра. Поэтому контраст живой клетки обусловлен почти исключительно преломлением света. Однако степень контраста можно сильно повысить, применив окрашивание. Обработка такими красителями, которые избирательно связываются, всей клеткой или определенными ее компонентами, приводит к значительно более сильному поглощению света. Большинство методов окрашивания вызывает гибель клеток, и поэтому перед окрашиванием клетки обычно фиксируют, т. е. проводят определенную их химическую обработку, чтобы по возможности уменьшить структурные изменения в клетках после их гибели. Обычно для этого применяют растворы, содержащие осмиевую кислоту и альдегиды, особенно часто глутаральдегид.
Микробные клетки чаще всего нет необходимости окрашивать, чтобы сделать их видимыми. Проще всего наблюдать микроорганизмы в живом состоянии, во влажном препарате, и для многих целей этого достаточно. Главная ценность окрашивания состоит в том, что оно дает возможность получать специфическую информацию о внутренней структуре клетки или ее химических свойствах. Например, специфическое окрашивание дезоксирибонуклеиновой кислоты позволяет выявить структуру и локализацию ядра. Много специальных методов окрашивания используется для получения данных о внутриклеточном отложении таких резервных материалов, как гликоген, полифосфаты и поли-р-оксимасляная кислота. Окраска по Граму и прочные кислые красители позволяют получать сведения о составе слоев клеточной стенки у бактерий. Иногда для выявления поверхностных слоев с очень низким показателем преломления, например слизи или капсул, часто окружающих клетки микробов, используют так называемые негативные красители, которые не проникают внутрь клетки. Такие слои можно выявить, добавив в среду, в которой суспендированы клетки, тушь. Содержащиеся в ней частицы угля не могут проникнуть через капсулу, и она выявляется в виде окружающей клетку светлой зоны.
При освещении небольшого объекта часть света рассеивается, и объект становится видимым как светящаяся точка на темном фоне. Это явление используется в методе темнопольного освещения, позволяющего выявлять такие объекты, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть при обычном освещении, или почему-либо не создают достаточного контраста. Такое освещение достигается с помощью специального конденсора, который фокусирует на препарате полый конус света, расходящиеся пучки которого не попадают в объектив. Через объектив проходит и создает изображение только тот свет, который рассеивается на объекте.
Подсветка образца в методе темнопольной микроскопии может осуществляться и в падающем свете. Изображение в этом случае создается светом, рассеивающимся на неоднородностях образца.
Ультрафиолетовая и флуоресцентная микроскопия
Так как разрешающая способность светового микроскопа находится в прямой зависимости от длины волны используемого света, можно несколько повысить разрешение (примерно вдвое), если освещать объект ультрафиолетовыми лучами. Для коротковолнового ультрафиолета стекло непрозрачно, поэтому линзы в таком микроскопе должны быть изготовлены из кварца; изображение приходится фотографировать, так как глаз ультрафиолетовых лучей не воспринимает. Из-за большой стоимости оборудования и его сложности ультрафиолетовая микроскопия находит лишь ограниченное применение. Однако ее модификация, так называемая флуоресцентная микроскопия, часто применяется для решения ряда важных биологических вопросов.