Что необходимо сделать с мазком перед окраской
Техника приготовления мазка
Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.
Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.
Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.
Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.
Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.
Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.
Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и извлечении оттуда сохраняет водную пленку.
Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.
Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде. Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.
Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и небольшим (с двухкопеечную монету).
Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде. На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.
Приготовление мазка из гноя или мокроты. Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два больших мазка.
Приготовление мазка из крови. Каплю крови наносят на предметное стекло на расстоянии одной трети от левого края. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45°, прикасаются к капле крови. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Правильно приготовленный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает.
Высушивание мазка
Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком вверх.
Внимание! При высокой температуре может произойти нарушение структуры клеток.
Фиксация мазка
Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.
Окраска препаратов
После фиксации приступают к окраске препарата.
Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе, покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты, цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.
Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.
Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический); коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый).
Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.
Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл весь препарат.
Рецепты красителей
1. Насыщенные спиртовые растворы (исходные):
Смесь помещают в термостат до полного растворения на несколько дней. Взбалтывают ежедневно. Хранят в склянках с притертыми пробками.
2. Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, спор и капсул):
Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот.
Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют и сливают во флакон для хранения.
3. Фуксин Пфейффера (для окраски по Граму и для простого метода окраски):
Краситель готовят непосредственно перед применением.
4. Карболовый генциановый фиолетовый (для окраски по Граму):
насыщенного спиртового раствора
Растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.
5. Раствор Люголя (для окраски по Граму и реактив на крахмал):
Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на сутки в термостат, затем добавляют 300 мл дистиллированной воды.
6. Щелочной раствор метиленового синего Леффлера:
7. Бумажки по Синеву (для окраски по Граму):
1% спиртовой раствор кристаллического фиолетового
Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.
Методы окраски делят на ориентировочные (простые) и дифференциальные (сложные), выявляющие химические и структурные особенности бактериальной клетки.
Простой метод окраски
На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Сложные методы окраски
Окраска по Граму (универсальный метод). Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.
Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.
Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.
1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.
2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.
3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.
2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.
3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Окраска по Ожешко (выявление спор). 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.
1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.
2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.
3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.
Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.
Что необходимо сделать с мазком перед окраской
Для того чтобы увидеть четкие контуры микроорганизмов, применяют метод биологического окрашивания. Клетки окрашенных микроорганизмов отчетливо выделяются на серебристо-белом фоне препарата, создавая яркую картину микробного пейзажа микроскопируемого объекта. Использование специальных методов окраски позволяет выявить некоторые морфологические структуры содержащихся в материале микробных клеток (наличие спор, капсул, жгутиков и пр.).
В микробиологии используют различные красители, подразделяемые по их способности окрашивать определенные структурные образования микробных клеток.
Обычно различают 4 большие группы красителей:
1. Основные (или ядерные) красители, избирательно окрашивающие ядро, и базофильные (от лат. basis — основной) структуры бактериальных клеток.
2. Кислые (или цитоплазматические) красители, которые окрашивают преимущественно цитоплазму, реже клеточные стенки.
3. Нейтральные красители, избирательно окрашивающие отдельные компоненты цитоплазмы; например, судан III или нильский синий окрашивают капельки жира.
4. Флюорохромы — группа красителей, способных флюоресцировать при той или иной длине волны возбуждающего света. Несмотря на то, что флюорохромы выделены в самостоятельную группу, большинство из них следовало бы отнести к цитоплазматическим красителям, реже к ядерным.
В таблице ниже представлены наиболее употребляемые в практике микробиологии основные и кислые красители.
Приготовление мазков для окрашивания. Мазки для микроскопии готовят из культур микробов с твердых и жидких питательных сред, клинического материала (мокроты, гноя, крови, осадка мочи, смЖ и пр.), из биоптатов, органов трупов. Техника приготовления мазков определяется физическими свойствами исследуемого материала.
1. Мазки из микробных культур с жидких питательных сред и жидкого патологического материала. Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят на предметное стекло бактериологической петлей и круговыми движениями последней распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром 8-10 мм. Мазки должны содержать достаточно материала для полноценно исследования, но не должны быть чрезмерно толстыми, так как содержащиеся в них клетки невозможно будет дифференцировать.
2. Мазки с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного предметного стекла наносят каплю водопроводной воды. В нее вносят бактериологической петлей небольшое количество исследуемой микробной культуры, чтобы капля воды стала слегка мутной. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени газовой горелки и приступают к изготовлению мазка по способу, описанному выше.
3. Мазки крови. На хорошо обезжиренное и свершено сухое предметное стекло наносят каплю крови, прикасаясь узким концом его непосредственно к уколу на пальце. Стекло держат большим и указательным пальцами левой руки каплей кверху. Второе шлифованное стекло, которое должно быть уже предметного, правой рукой ставят на первое под углом 40-45 ° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла.
Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем своем протяжении.
Приготовление толстой капли На середину хорошо обезжиренного сухого предметного стекла наносят каплю крови пастеровской пипеткой или непосредственно из места прокола пальца. Нанесенную на предметное стекло каплю крови размазывают бактериологической петлей до размера 8-10 мм в диаметре. Кровь в толстой кайле распределяется неравномерно, образуя неровный край. Предметное стекло с мазком оставляют в горизонтальном положении до высыхания крови.
Приготовление мазка крови
1-3 — объяснения в тексте
4. Мазки из слизистого отделяемого полости рта, носа, носоглотки и влагалища. Мазки с тампонов готовят путем прокатывания последних по предметному стеклу. Этот метод помогает сохранить морфологию и расположение клеток хозяина на участке, с которого получен материал.
5. Мазки из вязкого материала (мокрота, гной). При изготовлении мазков из мокроты исследуемый материал выливают в чашку Петри и выбирают из него частицы, содержащие гнойные комочки, в которых с наибольшей вероятностью могут быть обнаружены возбудители болезни. Мокроту или гной переносят на предметное стекло, ближе к одному из узких его краев, и накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу, а затем свободные от исследуемого материала концы стекол захватывают большими и указательными пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны.
При движении оба стекла должны плотно прилегать друг к другу. При таком способе приготовления мазка исследуемый материал, занимающий большую часть предметного стекла, распределяется тонким равномерным слоем.
6. Мазки из биоптатов и трупного материала. Поверхность исследуемого органа (биоптата или трупного материала) прожигают накаленными браншами пинцета с целью ее обеззараживания. По прокаленному месту делают разрез и затем из глубины ткани остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек. Если он мягкий, имеет рыхлую консистенцию, его помещают между двумя предметными стеклами и поступают так же, как при изготовлении мазка из гноя или мокроты. Если ткань органа плотная, то в глубине надреза скальпелем делают несколько как можно более тонких соскобов. Полученный материал распределяют по поверхности предметного стекла бактериологической петлей или скальпелем.
Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в них микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого небольшой кусочек ткани, вырезанный из середины органа, захватывают браншами пинцета и прикладывают к предметному стеклу последовательно несколько раз, получая таким образом ряд мазков-отпечатков.
Приготовление мазков из вязкого материала (мокроты, гноя)
7. Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленные на предметном стекле мазки высушивают на воздухе и после полного их высыхания фиксируют. Лучше всего сушить препарат на воздухе. Правильно приготовленный тонкий мазок высыхает в течение нескольких минут.
Температура (°С) в разных частях пламени газовой горелки 
Кювета с параллельными рейками для установки предметных стекол с целью фиксации препаратов
Различают физический и химический способы фиксации. Физический способ основан на воздействии высокой температуры на микробную клетку, химический — на применении химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.
— Физический способ фиксации. Предметное стекло берут за ребра со стороны узкого края пинцетом или большим и указательным пальцами правой руки таким образом, чтобы мазок находился на верхней поверхности стекла. Плавными движениями руки предметное стекло проносят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации занимает не более 2-3 с. Для проверки надежности фиксации свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной стороне левой кисти. При правильном фиксировании стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.
— Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют химические вещества или их соединения. Существуют два метода химической фиксации мазков: 1) предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксатором, затем высушивают на воздухе и микроскопируют; 2) на горизонтально установленные предметные стекла с мазками наносят по капле фиксатор и дают высохнуть. Время фиксации зависит от применяемых в качестве фиксаторов веществ.
Кроме приведенных в таблице веществ, для фиксации мазков применяется 40% коммерческий формалин. На дно чашки Петри наливают 4-5 мл формалина, а к крышке чашки прикрепляют предметное стекло мазком кнаружи. Фиксацию проводят парами формалина при слабом подогревании на водяной бане в течение 10 мин.
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 13.05.2019
Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология
Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология
Микроскопия Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (1 мкм = = 10 мм =10 м), возможно только с помощью микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст). Световая микроскопия включает в себя обычную просвечивающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-контрастную и люминесцентную.
Светлопольная микроскопия. Существуют различные модели учебных и исследовательских световых микроскопов, которые позволяют определить форму клеток микроорганизмов, их размер, подвижность, степень морфологической гетерогенности, а также характерную для микроорганизмов способность к дифференцирующему окрашиванию. Правила пользования микроскопом. Строгое соблюдение правил пользования микроскопом является непременным условием для каждого работающего с ним.
При работе необходимо соблюдать следующую последовательность:
При смене объектива, дающего малое увеличение, на объектив большего увеличения требуется соблюдение следующих правил:
| 1 | Прежде чем сменить объектив, рассматриваемый объект (или его участок) ставят в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении. Диаметр линзы уменьшается по мере возрастания степени увеличения, вследствие чего объект, если он лежит не в центре, при смене объектива может оказаться за пределами поля зрения. | Before changing the lens, the object in question (or its section) is placed in the center of the field of view of the microscope at low magnification. The diameter of the lens decreases as the magnification increases, as a result of which the object, if it is not in the center, may be out of sight when the lens is changed. |
| 2 | Слегка приподнимают тубус и затем переводят объектив с помо щью револьвера. Это необходимо потому, что объектив большего увели чения всегда бывает длиннее. | Slightly raise the tube and then transfer the lens with a revolver. This is necessary because the lens of higher magnification is always longer. |
| 3 | Для того чтобы в поисках фокусного расстояния не раздавить пре парат или, что еще хуже, не повредить линзу объектива, тубус с подведеннымпод него объективом, глядя для контроля сбоку микроскопа, опускают до самой поверхности препарата и затем, смотря в окуляр, очень медленно (чтобы не пропустить появления очертаний предмета) поднимают. | In order not to crush the preparation or, even worse, to damage the objective lens, while searching for the focal length, the tube with the objective underneath it, looking to control the side of the microscope, is lowered to the surface of the preparation and then, looking into the eyepiece, very slowly (so as not to miss the appearance of the outlines of the subject) raise. |
Рассматривают препарат в микроскоп левым глазом. Правый глаз при этом должен оставаться открытым. Левую руку держат на микрометрическом винте и слегка вращают его (влево и вправо).
Этим достигается возможность рассмотрения поверхностных и более глубоких участков объекта. Правой (свободной) рукой делают зарисовку того, что видно в поле зрения.
Правила работы с иммерсионным объективом. Сухой окрашенный препарат (приготовление см. ниже) помещают на столик микроскопа и, пользуясь объективом 8х, устанавливают свет.
Затем в центр препарата на мазок наносят каплю иммерсионного масла и заменяют сухую систему иммерсионной. С помощью макрометрического винта опускают тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Эту операцию нужно проводить очень осторожно, следя сбоку за тем, чтобы фронтальная линза не коснулась предметного стекла и не получила повреждения. После погружения объектива в масло осторожно, также пользуясь макровинтом, поднимают тубус и, наблюдая в окуляр, находят плоскость препарата. Точная фокусировка достигается с помощью микрометрического винта. По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сначала сухой хлопчатобумажной салфеткой, а затем той же салфеткой, но слегка смоченной ксилолом. Оставлять масло на поверхности линзы ни в коем случае нельзя, так как оно способствует фиксированию пыли и может со временем привести к повреждению оптики микроскопа. Изучение микроорганизмов в световом микроскопе.
Выбор методов микроскопического анализа и способов окраски определяется конкретной целью исследования.
Покровные стекла, применяемые для приготовления препаратов микроорганизмов, также должны быть тщательно вымыты и высушены. Толщина покровных стекол не должна превышать 0,15-0,17 мм. Более толстые покровные стекла резко ухудшают качество получаемого изображения. Препараты живых клеток микроорганизмов
2. «Висячая капля». Каплю суспензии микроорганизмов петлей наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна висеть свободно, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят на жидкой питательной среде. Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов
Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.
4. Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают простые и дифференциальные спо собы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а опре деленных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества. Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой.
Метод окрашивания в модификации
Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время. Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.