Что называется единицей активности фермента
Единицы измерения активности и количества фермента
1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.
В практике обычно используют:
Взаиморасчёт этих величин выглядит следующим образом:
1 катал = 1 моль/сек = 60 моль/мин = 60х10 6 мкмоль/мин = 6х10 7 ME
1ME = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/сек = 1/60 мккатал = 16, 67 нкат
Удельная активность фермента численно ровна количеству единиц активности фермента в биологическом образце (МЕ), делённому на массу (мг) белка в этой ткани. Обычно используется для оценки очистки фермента.
Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д.
При определении активности ферментов необходимо создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях – оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом. Кроме того необходимо при этом наличие избытка субстрата, чтобы работали все имеющиеся в растворе молекулы фермента.
5. От чего зависит активность ферментов?
Параграф 15 ферменты определение, природа, функции
Параграф 15: ФЕРМЕНТЫ (определение, природа, функции, классификация).
См. сначала п.57-59.
Содержание параграфа:
15. 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ферментов.
15. 2. ФУНКЦИЯ ферментов в организме и ЗНАЧЕНИЕ ферментов для организма.
15. 3. Недостаточная активность ферментов.
Последствия прекращения работы фермента.
Причины недостаточной активности фермента:
15. 4. Избыточная активность ферментов.
Последствия избыточной активности фермента.
Причины избыточной активности фермента:
15. 5. ЕДИНИЦЫ измерения активности ферментов.
15. 6. Химическая ПРИРОДА ферментов.
15. 7. ИСТОЧНИК ферментов в организме (откуда ферменты берутся в организме).
15. 8. Условия синтеза ферментов в клетках.
15. 9. Условия работы ферментов в клетках.
Кратко: в организме есть белки, способные ускорять (то есть катализировать) химические реакции. Эти белки называются ФЕРМЕНТАМИ.
Подробнее: в организме человека происходят превращения одних веществ в другие,
то есть химические реакции.
Многие реакции протекали бы с очень низкой скоростью,
при которой жизнь организма была бы невозможна,
если бы эти химические реакции не ускорялись специальными веществами,
которые называются катализаторами (ускорителями реакций).
Большинство катализаторов организма являются белками (другими словами, имеют белковую природу).
Такие белковые катализаторы (они же каталитические белки) называются ферментами.
15. 1. Определение ферментов. Что называют ферментами?
15. 2. Функция ферментов в организме
и значение ферментов для организма (нормальной активности ферментов).
Ферменты осуществляют КАТАЛИЗ химических реакций в организме.
То есть ферменты ускоряют химические реакции в организме.
В этом значение ферментов для организма.
Ферменты увеличивают скорость реакций в миллиард и более раз (в 105-1014 раз).
Ферменты ускоряют только те реакции, которые протекают и без помощи ферментов хотя бы с очень низкой скоростью.
Если реакция невозможна (не может протекать без катализатора в принципе даже очень медленно),
то и под влиянием фермента она не может ни ускориться, ни начаться.
То есть ферменты только ускоряют реакции, причём ускоряют только возможные реакции (возможные с точки зрения термодинамики).
Значение ферментов для организма в том, что
без работы ферментов в качестве катализаторов жизнь организма невозможна,
так как без участия ферментов большинство реакций организма
протекали бы с крайне низкой скоростью, что несовместимо с жизнью.
Термины:
Вещество, реакцию превращения которого в другое вещество (в продукт реакции) катализирует фермент,
называется СУБСТРАТОМ фермента.
Вещество, которое образуется в результате химической реакции (из субстрата), называется продуктом реакции.
В обратимых реакциях продукт одной реакции является субстратом обратной реакции и наоборот.
15. 3. Недостаточная активность ферментов.
Последствия прекращения работы фермента:
прекращение работы фермента (недостаточная активность фермента)
приводит к резкому снижению скорости реакции данного фермента
(то есть скорости реакции, которую мог бы катализировать этот фермент),
что приводит к накоплению субстрата реакции
и к дефициту продукта реакции.
Накопление ряда субстратов и дефицит ряда продуктов
нарушают жизнедеятельность организма,
могут ухудшать самочувствие, приводить к развитию заболеваний и к смерти.
Например, накопление такого субстрата, как аммиак (в случае прекращения работы ферментов синтеза мочевины),
или дефицит такого продукта, как АТФ (в случае прекращения работы ферментов, катализирующих реакции синтеза АТФ),
приводят к смерти.
Накопление такого субстрата, как фенилаланин (п.68) может привести к развитию олигофрении.
Но если нет субстрата фермента, то не будет проблем и из-за накопления субстрата реакции. При условии, что можно обойтись без продукта реакции.
Причины недостаточной активности молекул фермента:
Кроме того, может быть недостаточным количество молекул фермента (концентрация фермента в клетке).
Причины дефицита молекул фермента:
1. Снижение скорости синтеза (см. далее).
2. Нарушение транспорта молекул данного фермента в нужную часть клетки или из клетки (нарушение секреции).
3. Повышение скорости расщепления данного белка (протеолиза)
или всех белков клетки (например, при разрушении лизосом).
4. Денатурация белков при нагревании, ацидозе и алкалозе, появлении веществ, вызывающих денатурацию белков.
15. 4. Избыточная активность ферментов.
Последствия избыточной активности фермента:
избыточная активность фермента
приводит к повышению скорости реакции данного фермента
(то есть скорости реакции, которую катализирует этот фермент),
что приводит к дефициту субстрата реакции
и к образованию избытка продукта реакции.
Накопление ряда продуктов и дефицит ряда субстратов
нарушают жизнедеятельность организма,
могут ухудшать самочувствие, приводить к развитию заболеваний и к смерти.
Например, накопление такого продукта, как мочевая кислота
(в случае избыточной активности ферментов синтеза мочевой кислоты),
приводят к развитию ПОДАГРЫ, которая может привести к почечной недостаточности.
Но если нет субстрата фермента, то не будет и проблем из-за избытка продукта.
При условии, что можно обойтись без субстрата и продукта.
Причины избыточной активности молекул фермента:
1. МУТАЦИЯ ГЕНА, кодирующего данный фермент, из-за которой данный фермент становится чрезмерно активным;
мутация может быть врождённой из-за влияния мутагенов на организмы родителей
или приобретённой в течение жизни индивида под влиянием мутагенов.
Для коррекции нужна генотерапия, которая в настоящее время пока не развита.
2. Избыток в пище или воде микроэлемента или витамина,
необходимого для работы этого фермента
(эта причина устраняется снижением поступления этих веществ с водой и пищей).
Например, избыток витамина С может привести к неправильному заживлению ран (слишком быстрому рубцеванию ран), так как приводит к чрезмерной активности ферментов синтеза коллагена.
Кроме того, может образоваться избыток молекул фермента
при повышении скорости синтеза данного фермента или
при снижении скорости расщепления данного фермента.
15. 5. Единицы измерения активности ферментов.
Активность ферментов измеряется в том,
какое количество субстрата превратилось за единицу времени (в продукт)
или какое количество продукта образовалось за единицу времени (из субстрата).
(То есть насколько изменилась концентрация субстрата или продукта за единицу времени).
15. 6. Химическая природа ферментов.
15. 7. Источник ферментов в организме
(откуда ферменты берутся в организме).
Как и все белки организма, ферменты образуются в организме
в результате процесса, который называется СИНТЕЗОМ БЕЛКА.
Синтез белка (и ферментов в том числе) протекает только в клетках.
После синтеза ряд белков может секретироваться (выделяться) из клеток во внеклеточную среду
(например, антибактериальный лизоцим, ферменты плазмы крови и т.д.)
15. 8. Условия синтеза ферментов в клетках.
Для синтеза ферментов (как и других белков) требуются:
1) наличие «сырья» в клетке: БЕЛКОВЫХ АМИНОКИСЛОТ всех 20-ти типов,
2) наличие в клетке ГЕНА, кодирующего данный фермент (первичную структуру фермента, порядок соединения аминокислотных остатков в данной молекуле белка),
3) (иногда) наличие в клетке ВИТАМИНОВ И МИКРОЭЛЕМЕНТОВ (ионов металлов и селена),
4) ряд регуляторов синтеза белков (активаторы транскрипции и т.д.),
5) отсутствие ингибиторов синтеза белков (например, дифтерийного токсина),
6) нормальные условия в клетке: температура, рН и т.д.
Чтобы были все 20 типов аминокислот (для синтеза в клетке ферментов и других белков и веществ),
в пище должны присутствовать в нужных количествах незаменимые аминокислоты
в составе белков таких продуктов, как:
молочные, мясо, рыба, яйца, соя и другие бобовые.
Витамины и минералы тоже поступают в организм в основном в составе пищи (кроме этого, некоторое количество витаминов может синтезироваться и поставляться организму человека микрофлорой кишечника,
витамин Д может синтезироваться в коже под действием света, но не входит в состав белков,
дефицит витамина РР может отчасти компенсироваться синтезом коферментов НАД+ и НАДФН из триптофана при его достатке в пище).
Гены должны быть такими, чтобы кодировать
ферменты с нормальной активностью (не слишком высокой и не низкой),
которые могут регулироваться.
Изменение гена (мутация) может привести
к появлению фермента с низкой или чрезмерной активностью,
что может привести к развитию патологии.
Причиной мутации может стать действие мутагенов:
радиации, химических веществ, вирусов.
Поэтому желательно не засорять биосферу мутагенами.
15. 9. Условия работы ферментов в клетках.
Что означает выражение «активность фермента»?
Прежде чем обсуждать свойства ферментов и зависимость ферментов от каких-либо факторов необходимо определиться с понятием активность ферментов.
Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные:
Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие – это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:
1. На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
2. На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей – бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
3. На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?
Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.
В практике обычно используют:
В настоящее время в основном уже применяются единицы активности – катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.
Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д.
Принципы количественного определения активности ферментов
2. Необходимо наличие избытка субстрата, чтобы в течение установленного времени работали все имеющиеся в растворе молекулы фермента.
Определение активности ферментных препаратов (ОФС.1.2.4.0013.15)
» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>
Определение активности ферментных препаратов (ОФС.1.2.4.0013.15)
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы определения активности ферментов, которые основаны на определении скорости превращения субстратов для действия энзимов в соответствующие продукты ферментативной реакции, которые они катализируют.
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
ОФС.1.2.4.0013.15 Определение активности ферментных препаратов
Взамен ГФ XI, вып.2, стр. 25
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы определения активности ферментов, которые основаны на определении скорости превращения субстратов для действия энзимов в соответствующие продукты ферментативной реакции, которые они катализируют.
Классификация ферментов
Фермент (E) – белок, обладающий каталитическими свойствами в реакции преобразования субстрата (S) в продукт (P).
Согласно международной номенклатуре (табл.), все ферменты подразделяются на 6 классов в зависимости от типа катализируемых ими реакций.
Таблица. Классификация ферментов
Особенности измерения активности ферментов, описываемые в фармакопейных статьях, определяется их принадлежностью к тому или иному классу.
Принцип, положенный в основу всех методов определения активности фермента (Е), заключается в регистрации скорости убыли субстрата (S) (то есть вещества, на которое действует фермент) или скорости образования продукта реакции (P).
Простейшей схемой для описания кинетики ферментативных реакций является так называемая двухстадийная схема:
Е – фермент;
S – субстрат;
P – продукты реакции;
kкат – каталитическая константа.
Начальная скорость (υo) катализируемой ферментом реакции, при которой расходом субстрата можно пренебречь, описывается уравнением Михаэлиса–Ментен (2):
Для аллостерических ферментов начальная скорость ферментативной реакции не подчиняется уравнению Михаэлиса–Ментен.
Для определения скорости ферментативной реакции через определенные промежутки времени отбирают пробы из реакционной смеси и проводят количественное определение методами, основанными чаще всего на спектральных свойствах субстрата или продукта реакции.
Требования к условиям проведения ферментативной реакции
Ферментативная реакция должна проводиться в строго определенных условиях с учетом следующих факторов.
1.Начальная скорость реакции (хo).
Скорость ферментативной реакции количественно можно измерить по убыли субстрата или по образованию продукта реакции.
Типичные кинетические кривые ферментативной реакции приведены на рис. 1. Для каждой ферментативной реакции могут быть подобраны условия, при которых начальный участок кривой линеен, т. е. зависимость концентрации образовавшегося продукта или израсходованного субстрата от времени наблюдения имеет прямо пропорциональный характер.
Рисунок 1. Типичные кинетические кривые ферментативной реакции:
А – регистрация по скорости исчезновения субстрата реакции;
Б – регистрация по скорости образования продукта реакции
Начальная скорость реакции (υo) определяется как тангенс угла наклона линейного участка кривой.
Поскольку длительность прямолинейного участка кинетической кривой от опыта к опыту несколько изменяется, время инкубации (при использовании метода отбора проб) должно составлять не более 70 % и не менее 20% времени соответствующего прямолинейного участка.
2.Концентрация субстрата ([S]0).
В большинстве случаев зависимость начальной скорости ферментативной реакции (хo) от начальной концентрации субстрата ([S]0), согласно уравнению Михаэлиса–Ментен (2) описывается гиперболической функцией (рис. 2).
Начальная скорость реакции (υo) зависит от начальной концентрации субстрата ([S]0) вплоть до его насыщающей концентрации. Под насыщающей концентрацией ([S]нас) понимают такую концентрацию субстрата, при которой начальная скорость реакции практически перестает повышаться при дальнейшем увеличении концентрации субстрата, стремясь к своему предельному значению, называемому максимальной скоростью реакции Vмакс (рис. 2). Отрезок на оси абсцисс, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять собой Км. При проведении ферментативной реакции реакционная смесь должна содержать такое количество субстрата, которое обеспечит насыщение фермента в течение всего хода определения (количество субстрата, взятого для проведения ферментативной реакции, должно быть примерно на 30% выше насыщающей концентрации).
Если форма кривой зависимости начальной скорости реакции (υo) от начальной концентрации субстрата ([S]0) отличается от гиперболической, определение параметров по уравнению Михаэлиса–Ментен невозможно. Такие отклонения наблюдаются в случае ингибирования или активации фермента субстратом, а также при работе с аллостерическими ферментами. В этом случае оптимальной является та концентрация субстрата, при которой начальная скорость реакции максимальна ([S]опт)– точка перегиба на экспериментальной кривой зависимости начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата (рис. 2).
После выбора насыщающей концентрации субстрата необходимо проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [P] от t.
В качестве субстратов используются как природные вещества, такие как альбумин, казеин, крахмал, так и синтетические. Природные субстраты ферментов используют большей частью для подтверждения подлинности. Синтетические субстраты обеспечивают более высокую точность и лучшую воспроизводимость при количественном определении ферментативной активности.
3.Концентрация фермента ([Е]0).
В соответствии с уравнением Михаэлиса–Ментен начальная скорость ферментативной реакции (хo) в подавляющем большинстве случаев линейно зависит от концентрации фермента ([E]0). Выбор оптимальной для каждого метода концентрации фермента осуществляется экспериментально при помощи построения кривой зависимости начальной скорости реакции от концентрации фермента (рис. 3).
После выбора начальной концентрации фермента необходимо проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [P] от t при выбранном значении насыщающей концентрации субстрата.
4. Температура.
Особенностью ферментативных реакций является наличие колоколообразной зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком интервале температур, которая характеризуется «температурным оптимумом» реакции. Эта особенность объясняется наложением 2 эффектов: возрастанием скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при достаточно высоких температурах. Обычно ферментативную реакцию рекомендуется проводить в термостате при температуре (37 ± 0,1) ºС, если нет иных указаний в фармакопейной статье. Предварительно каждый из реагентов нагревают до температуры 37º С.
5. Значение рН.
Типичная кривая, описывающая для большинства ферментов рН-зависимость начальной скорости ферментативной реакции при наличии 2 ионогенных групп в активном центре фермента, приведена на рис. 4.
Определение активности следует проводить при оптимальном значении рН, определенном при выбранных значениях концентрации фермента и насыщающей концентрации субстрата; использовании буферного раствора того состава, который не ингибирует фермент и температуре (37 ± 0,1) ºС, если нет других указаний в фармакопейной статье.
После выбора оптимального значения рН необходимо проверить, сохраняется ли при этом рН линейная зависимость [P] от t при выбранных значениях концентрации фермента и насыщающей концентрации субстрата.Рисунок 4 – Зависимость начальной скорости реакции υ0 от значения рН
6.Кофакторы.
Для определения оптимальной концентрации кофактора следует построить кривую зависимости начальной скорости реакции от начальной концентрации кофактора, аналогичную зависимости начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата, и по этой кривой выбрать насыщающую концентрацию кофактора.
После выбора насыщающей концентрации кофактора необходимо проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [P] от t.
Конкретные параметры ферментативной реакции указываются в фармакопейных статьях.
Способы детекции
Для количественной регистрации скорости ферментативной реакции используют спектрофотометрические, флюресцентные, хеми- и биолюминесцентные методы детекции, основанные на спектральных свойствах субстрата или продукта реакции, а также детекцию с помощью микрокалориметрических датчиков и биодатчиков (биосенсоров) на основе хеми- и биолюминесценции; электрохимические методы, такие как потенциометрия, амперометрия и др. Для одних видов анализа детекция может проводиться непрерывно в ходе реакции, для других – после ее остановки.
Способ остановки ферментативной реакции должен быть указан в фармакопейной статье.
Единицы измерения ферментативной активности
Активность фермента измеряется количеством субстрата, преобразованного в продукт в единицу времени, и выражается в Международных единицах (МЕ) или единицах действия (ЕД).
МЕ – это такое количество фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата за 1 мин (или одного микроэквивалента затронутых реакцией групп в тех случаях, когда атакуется более одной группы в каждой молекуле субстрата).
ЕД – это условная единица активности фермента, величина которой указывается в фармакопейной статье.
Перевод единиц активности ЕД в МЕ и обратно осуществляется опытным путем на основании статистически достаточного материала, обработанного в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».
Определение активности ферментных препаратов в сравнении со стандартным образцом (СО)
С целью снижения погрешности методов определения ферментативной активности необходимо проводить определение ферментативной активности препарата в сравнении со стандартным образцом (СО) данного фермента.
Определение ферментативной активности испытуемого препарата и СО проводят в одинаковых условиях опыта.
Активность препарата (А) в соответствующих единицах (МЕ или ЕД) вычисляют по формуле:
А0 – ферментативная активность СО в единицах (МЕ или ЕД) на 1мг белка или препарата;
П – величина измеряемого параметра для СО;
П0 – величина измеряемого параметра для испытуемого препарата;
К – коэффициент, выравнивающий концентрации растворов испытуемого препарата и СО.
Определение активности иммобилизованных ферментов
Иммобилизованными называются ферменты, молекулы которых физически или химически связаны с каким-либо носителем. В качестве носителей могут быть использованы природные и синтетические полимеры, органические низкомолекулярные носители, неорганические материалы. В зависимости от природы носителя иммобилизованные ферменты могут существовать в форме гелей, пленок, гранул, макропористых порошков и в других формах.
Активность иммобилизованных ферментов может нормироваться на массу носителя или его площадь.
Кинетические характеристики иммобилизованных ферментов, численно определяемые константой Михаэлиса Км и каталитической константой kкат, могут существенно изменяться в зависимости от природы носителя и способа иммобилизации. Поэтому для корректного определения активности иммобилизованных ферментов необходим повторный подбор условий.